Importancia aplicada de la biología molecular. Biología molecular aplicada. Excursión histórica a las etapas de desarrollo de la biología molecular.

Un biólogo molecular es un investigador médico cuya misión es, nada menos, salvar a la humanidad de enfermedades peligrosas. Entre estas enfermedades, por ejemplo, la oncología, que hoy se ha convertido en una de las principales causas de mortalidad en el mundo, es sólo ligeramente inferior a la líder: las enfermedades cardiovasculares. Nuevos métodos para el diagnóstico precoz de la oncología, la prevención y el tratamiento del cáncer son una prioridad medicina moderna. Los biólogos moleculares en el campo de la oncología desarrollan anticuerpos y proteínas recombinantes (diseñadas genéticamente) para el diagnóstico temprano o la administración específica de medicamentos en el cuerpo. Los especialistas en este campo utilizan los logros más modernos de la ciencia y la tecnología para crear nuevos organismos y sustancias orgánicas para su uso posterior en investigación y actividades clínicas. Entre los métodos que utilizan los biólogos moleculares se encuentran la clonación, la transfección, la infección, la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de genes y otros. Una de las empresas interesadas en los biólogos moleculares en Rusia es PrimeBioMed LLC. La organización se dedica a la producción de reactivos de anticuerpos para el diagnóstico del cáncer. Dichos anticuerpos se utilizan principalmente para determinar el tipo de tumor, su origen y malignidad, es decir, la capacidad de metastatizar (diseminarse a otras partes del cuerpo). Los anticuerpos se aplican a secciones delgadas del tejido que se examina, después de lo cual se unen en las células a ciertas proteínas, marcadores que están presentes en las células tumorales pero ausentes en las sanas y viceversa. Dependiendo de los resultados del estudio, se prescribe tratamiento adicional. Entre los clientes de PrimeBioMed no sólo se encuentran instituciones médicas, sino también científicas, ya que los anticuerpos también pueden utilizarse para resolver problemas de investigación. En tales casos, se pueden producir anticuerpos únicos que pueden unirse a la proteína de interés, bajo tarea específica por pedido especial. Otro dirección prometedora La investigación de la empresa se centra en la administración dirigida de fármacos al organismo. En este caso, los anticuerpos se utilizan como transporte: con su ayuda, los medicamentos se administran directamente a los órganos afectados. Por tanto, el tratamiento se vuelve más eficaz y tiene menos consecuencias negativas para el organismo que, por ejemplo, la quimioterapia, que afecta no sólo a las células cancerosas, sino también a otras células. Profesión biólogo molecular Se espera que en las próximas décadas la demanda sea cada vez mayor: con un aumento duración promedio A lo largo de la vida humana, el número de enfermedades cancerosas aumentará. El diagnóstico precoz de tumores y los métodos de tratamiento innovadores que utilizan sustancias obtenidas por biólogos moleculares salvarán vidas y mejorarán su calidad para un gran número de personas.

Educación vocacional básica

Los porcentajes reflejan la distribución de especialistas con cierto nivel de educación en el mercado laboral. Las especializaciones clave para dominar la profesión están marcadas en verde.

Habilidades y destrezas

• Capacidad para manipular reactivos, muestras, necesidad de poder trabajar con objetos pequeños.
• Habilidades para trabajar con grandes cantidades de información.
• Capacidad para trabajar con las manos.

Intereses y preferencias

• El deseo de aprender algo nuevo.
• Capacidad de realizar múltiples tareas (es necesario monitorear el progreso de varias reacciones y procesos simultáneamente)
• Exactitud
• Responsabilidad (no se puede dejar el trabajo “para mañana”, ya que las muestras pueden dañarse)
• Escrupulosidad
• Trabajo duro
• Atención (es necesario controlar los microprocesos)

Profesión en personas

María Shitova

Daria Samoilova

Alexéi Grachev

Biología Molecular en el campo de la oncología es una dirección profesional prometedora, ya que la lucha contra el cáncer es una de las prioridades de la medicina mundial.

Los biólogos moleculares tienen demanda en muchas áreas debido al desarrollo activo de empresas científicas, biotecnológicas e innovadoras. Hoy en día existe una ligera escasez de especialistas, especialmente aquellos con cierta experiencia en su especialidad. Hasta ahora, un número bastante grande de graduados continúa yendo a trabajar al extranjero. Ahora están empezando a surgir oportunidades para un trabajo eficaz en el campo de la biotecnología en Rusia, pero es demasiado pronto para hablar de escala masiva.

El trabajo de un biólogo molecular requiere de la participación activa de un especialista en actividades científicas, lo que se convierte en un mecanismo de avance profesional. El desarrollo en la profesión es posible mediante la participación en proyectos y conferencias científicas, y quizás mediante el desarrollo de campos de conocimiento relacionados. También es posible en el futuro el desarrollo académico desde un investigador junior, pasando por un investigador senior, hasta un investigador líder, profesor y/o jefe de departamento/laboratorio.

entrevista

Pirogov Sergey: participante en la preparación para la Olimpiada de Biología organizada por "El Elefante y la Jirafa" en 2012.
Ganador de la Universiada Internacional de Biología.
Ganador de la Olimpiada Lomonosov
Ganador de la etapa regional Olimpiada de toda Rusia en biología en 2012
Estudiando en la Universidad Estatal de Moscú. MV Lomonosov en la Facultad de Biología: Departamento de Biología Molecular, sexto año. Trabaja en el laboratorio de genética bioquímica de animales del Instituto de Genética Molecular.

- Seryozha, si los lectores tienen preguntas, ¿podrán hacértelas?

Sí, por supuesto, puedes hacer preguntas de inmediato. En este campo:

Haga clic para hacer una pregunta.

- Empecemos por la escuela, ¿no te parecía que tu escuela fuera súper genial?

Estudié en una escuela muy débil en Moscú, una escuela secundaria estadísticamente promedio. Es cierto que tuvimos un profesor maravilloso de MHC, gracias al cual tuvimos, en muchos sentidos, una orientación nominal de “historia del arte” de la escuela.

- ¿Qué pasa con la biología?

Nuestra biología la enseñaba una mujer muy mayor, algo sorda y dura, a quien todos temían. Pero eso no añadió amor a su tema. Me ha fascinado la biología desde pequeño, desde los cinco años. Yo mismo leo todo, principalmente porque me interesa la anatomía y la zoología. Entonces las materias escolares existían paralelas a mis propios intereses. Los Juegos Olímpicos lo cambiaron todo.

- Cuéntame más acerca de esto.

En 7º grado participé por primera vez en la etapa municipal (por supuesto, en casi todas las materias a la vez, ya que yo era el único alumno a quien los profesores tenían motivos para enviar). Y se convirtió en el ganador en biología. Luego, la escuela trató esto como un hecho divertido, pero no muy interesante.

- ¿Te ayudó en la escuela?

Recuerdo que, a pesar de mis brillantes estudios, a menudo recibía notas B de mi profesor de biología por objeciones como “en el dibujo de una sección transversal de una cebolla, las raíces deben ser de color marrón, no gris”. Todo fue bastante deprimente. En octavo grado volví a asistir a las Olimpiadas, pero por alguna razón no me aceptaron en biología. Pero se convirtió en un ganador y premiado en otras materias.

- ¿Qué pasó en noveno grado?

En noveno grado no pasé a la etapa distrital. Allí obtuve inesperadamente una puntuación débil y casi límite, que finalmente me permitió pasar a la fase regional. Esto tuvo una poderosa fuerza motivadora: la comprensión de cuánto no sé y cuántas personas saben todo esto (tenía incluso miedo de imaginar cuántas personas así a escala nacional).

- Cuéntame cómo te preparaste.

El autoestudio intensivo, las incursiones en librerías y miles de tareas del año pasado tuvieron un efecto curativo. Obtuve uno de los puntos más altos en teoría (lo cual también fue completamente inesperado para mí), pasé a la etapa práctica... y reprobé. En ese momento ni siquiera sabía de la existencia de la etapa práctica.

- ¿Te influyeron los Juegos Olímpicos?

Mi vida ha cambiado radicalmente. Aprendí sobre muchas otras Olimpíadas y, especialmente, me enamoré de la ShBO. Posteriormente, mostró buenos resultados en muchos, ganó algunos y, gracias a Lomonosovskaya, recibió el derecho de admisión sin exámenes. Al mismo tiempo, gané las Olimpiadas de Historia del Arte, por las que todavía respiro de manera desigual. Es cierto que nunca fui amigo de los recorridos prácticos. En 11° grado finalmente llegué a la etapa final, pero la fortuna no me fue favorable y esta vez no tuve tiempo de llenar la matriz de respuestas de la etapa teórica. Pero esto me permitió ya no preocuparme demasiado por cuestiones prácticas.

-¿Has conocido a muchos deportistas olímpicos?

Sí, sigo pensando que tuve mucha suerte con el círculo de mis compañeros, que ampliaron enormemente mis horizontes. Otra faceta de las Olimpíadas, además de la motivación para estudiar el tema de forma más armoniosa, fue el conocimiento de los participantes en las Olimpiadas. Ya en ese momento me di cuenta de que la comunicación horizontal a veces es más útil que la vertical, con los profesores en los campos de entrenamiento.

- ¿Cómo entraste a la universidad? ¿Elegiste una facultad?

Después del undécimo grado, ingresé al departamento de biología de la Universidad Estatal de Moscú. La mayoría de mis camaradas de entonces optaron por el FBB, pero aquí el papel principal lo jugó el hecho de que yo no me convertí en un ganador del premio de toda Rusia. Esto significa que tendría que aprobar un examen interno de matemáticas, pero en él, especialmente en matemáticas escolares (me encantaban mucho más las matemáticas superiores), no era fuerte. Y en el colegio había muy poca preparación (ni siquiera estábamos preparados para casi toda la parte C). En términos de intereses, ya entonces supuse que, en última instancia, era posible lograr cualquier resultado, independientemente del lugar de admisión. Posteriormente resultó que muchos graduados de la FBB se dedicaron predominantemente a la biología húmeda, y viceversa: muchos buenos bioinformáticos empezaron como aficionados. Aunque en ese momento me pareció que el contingente del departamento de biología sería mucho más débil que el del FBB. Ciertamente me equivoqué en esto.

¿Sabías?

Interesante

¿Sabías?

Interesante

En el campamento de Elefantes y Jirafas se realizan turnos en bioquímica y biología molecular, donde los escolares, junto con profesores experimentados de la Universidad Estatal de Moscú, realizan experimentos y también se preparan para las Olimpíadas.

© La entrevista fue realizada por Denis Reshetov. Las fotos fueron amablemente proporcionadas por Sergey Pirogov.

Biología Molecular / mə yoɛ Ajʊ yoər / Es una rama de la biología que se ocupa de las bases moleculares de la actividad biológica entre biomoléculas en varios sistemas células, incluidas las interacciones entre ADN, ARN, proteínas y su biosíntesis, así como la regulación de estas interacciones. Matricularse en naturaleza En 1961, Astbury describió la biología molecular:

No tanto una técnica como un acercamiento, un acercamiento desde el punto de vista de las llamadas ciencias básicas con la idea principal de buscar debajo de las manifestaciones a gran escala de la biología clásica el plano molecular correspondiente. Le preocupa, en particular, formas moléculas biológicas y [...] predominantemente tridimensionales y estructurales, lo que no significa, sin embargo, que se trate simplemente de un refinamiento de la morfología. Al mismo tiempo debe investigar la génesis y las funciones.

Relación con otras ciencias biológicas

Los investigadores de biología molecular utilizan técnicas específicas de la biología molecular, pero cada vez más las combinan con métodos e ideas de la genética y la bioquímica. No existe una línea clara entre estas disciplinas. Esto se ilustra en el siguiente diagrama, que muestra un posible tipo de relación entre campos:

• Bioquímica Es el estudio de las sustancias químicas y los procesos vitales que ocurren en los organismos vivos. A los bioquímicos les resulta difícil centrarse en el papel, la función y la estructura de las biomoléculas. El estudio de la química detrás de los procesos biológicos y la síntesis de moléculas biológicamente activas son ejemplos de bioquímica.
• Genética Es el estudio de la influencia de las diferencias genéticas en los organismos. Esto a menudo puede deducirse de la ausencia de un componente normal (por ejemplo, un gen). El estudio de los "mutantes" son organismos que tienen uno o más componentes funcionales en relación con el llamado "tipo salvaje" o fenotipo normal. Las interacciones genéticas (epistasis) a menudo confunden las interpretaciones simples de tales estudios "knockout".
• Biología Molecular es el estudio de las bases moleculares de los procesos de replicación, transcripción, traducción y función celular. El dogma central de la biología molecular, según el cual el material genético se transcribe en ARN y luego se traduce en proteínas, aunque demasiado simplificado, sigue siendo un buen punto de partida para comprender este campo. El panorama se ha revisado a la luz de las nuevas funciones emergentes para el ARN.

Métodos de biología molecular

Clonación molecular

Una de las técnicas de biología molecular más básicas para estudiar la función de las proteínas es la clonación molecular. En esta técnica, el ADN que codifica la proteína de interés se clona mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o enzimas de restricción en un plásmido (vector de expresión). El vector tiene 3. características distintivas: origen de replicación, un sitio de clonación múltiple (MCS) y un marcador seleccionable, generalmente para la resistencia a los antibióticos. Aguas arriba del sitio de clonación múltiple se encuentran las regiones promotoras y del sitio de inicio de la transcripción que regulan la expresión del gen clonado. Este plásmido se puede insertar en células bacterianas o animales. La introducción de ADN en células bacterianas se puede realizar mediante transformación mediante absorción de ADN desnudo, conjugación mediante contactos célula-célula o mediante transducción con un vector viral. Introducción de ADN en células eucariotas, como células animales, mediante métodos físicos o quimicos, se llama transfección. Se encuentran disponibles varios métodos de transfección diferentes, como la transfección con fosfato cálcico, la electroporación, la microinyección y la transfección liposomal. El plásmido puede integrarse en el genoma, lo que da como resultado una transfección estable, o puede permanecer independiente del genoma, lo que se denomina transfección transitoria.

El ADN que codifica las proteínas de interés ahora se encuentra dentro de la célula y las proteínas ahora pueden expresarse. Una variedad de sistemas, como promotores inducibles y factores de señalización celular específicos que ayudarán a expresar el interés de las proteínas en niveles altos. Grandes cantidades Luego, las proteínas se pueden extraer de la célula bacteriana o eucariota. Se puede probar la actividad enzimática de una proteína en diversas situaciones, se puede cristalizar la proteína para poder estudiar su estructura terciaria o, en la industria farmacéutica, se puede estudiar la actividad de nuevos fármacos contra la proteína.

Reacción en cadena de la polimerasa

Transferencia e investigación de macromoléculas.

Términos del Norte , Oeste Y oriental blotting deriva de lo que originalmente era una broma de biología molecular que jugaba con el término Red del sur, siguiendo la técnica descrita por Edwin Southern para la hibridación de ADN BLOTTED. Patricia Thomas, desarrolladora de la transferencia de ARN, que luego se conoció como norte - secante, realmente no uses ese término.

transferencia del sur

La transferencia Southern, que lleva el nombre de su inventor, el biólogo Edwin Southern, es un método para probar la presencia de una secuencia de ADN específica en una muestra de ADN. Las muestras de ADN antes o después de las digestiones con enzimas de restricción (enzimas de restricción) se separan mediante electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana mediante transferencia mediante acción capilar. Luego, la membrana se expone a una sonda de ADN marcada, que tiene una secuencia de bases complementaria a la secuencia del ADN de interés. La transferencia Southern se usa menos en el laboratorio científico debido a la capacidad de otros métodos, como la PCR, para detectar secuencias de ADN específicas a partir de muestras de ADN. Sin embargo, estas transferencias todavía se utilizan para algunas aplicaciones, como medir el número de copias de transgenes en ratones transgénicos o en líneas de células madre embrionarias knockout de ingeniería genética.

transferencia Northern

Gráfico de transferencia Northern

mancha oriental

Estudios clínicos y metodos medicos Los tratamientos derivados de la biología molecular están parcialmente cubiertos por la terapia génica. La aplicación de los enfoques de la biología molecular o de la biología celular molecular a la medicina ahora se llama medicina molecular. La biología molecular también juega papel importante en la comprensión de la educación, las acciones y las regulaciones varias partes Células que se pueden utilizar para atacar eficazmente nuevos fármacos, diagnosticar enfermedades y comprender la fisiología celular.

Otras lecturas

• Cohen, SN, Chang, NKD, Boyer, H. y Heling, R.B. Construcción de plásmidos bacterianos biológicamente funcionales in vitro .

Los avances en el estudio de los ácidos nucleicos y la biosíntesis de proteínas han llevado a la creación de una serie de métodos que son de gran importancia aplicada en la medicina, la agricultura y otras industrias.

Después de que se estudiaron el código genético y los principios básicos de almacenamiento e implementación de información hereditaria, el desarrollo de la biología molecular se paralizó, ya que no existían métodos que permitieran manipular genes, aislarlos y cambiarlos. La aparición de estos métodos se produjo en los años 1970-1980. Esto dio un poderoso impulso al desarrollo de este campo de la ciencia, que todavía hoy florece. En primer lugar, estos métodos se relacionan con la obtención de genes individuales y su introducción en las células de otros organismos (clonación y transgénesis molecular, PCR), así como métodos para determinar la secuencia de nucleótidos en genes (secuenciación de ADN y ARN). A continuación se analizarán estos métodos con más detalle. Comenzaremos con el método básico más simple: la electroforesis y luego pasaremos a métodos más complejos.

ELECTROFORESIS DE ADN

Este es el método básico para trabajar con ADN, que se utiliza junto con casi todos los demás métodos para aislar las moléculas deseadas y analizar los resultados. La electroforesis en gel se utiliza para separar fragmentos de ADN por longitud. El ADN es un ácido; sus moléculas contienen residuos de ácido fosfórico, que eliminan un protón y adquieren una carga negativa (Fig. 1).

Por lo tanto en campo eléctrico Las moléculas de ADN se mueven hacia el ánodo, un electrodo cargado positivamente. Esto ocurre en una solución de electrolito que contiene iones portadores de carga, lo que hace que la solución conduzca corriente. Para separar los fragmentos se utiliza un gel denso a base de polímeros (agarosa o poliacrilamida). Las moléculas de ADN se "enredan" en él cuanto más largas son y, por lo tanto, las moléculas más largas se mueven más lentamente y las más cortas se mueven más rápido (Fig. 2). Antes o después de la electroforesis, el gel se trata con tintes que se unen al ADN y son fluorescentes con luz ultravioleta, y se obtiene un patrón de bandas en el gel (ver Fig. 3). Para determinar las longitudes de los fragmentos de ADN de la muestra, se comparan con un marcador: un conjunto de fragmentos de longitudes estándar aplicados en paralelo al mismo gel (Fig. 4).

Las herramientas más importantes para trabajar con el ADN son las enzimas que llevan a cabo transformaciones del ADN en células vivas: ADN polimerasas, ADN ligasas y endonucleasas de restricción o restrictasas. ADN polimerasas Llevar a cabo la síntesis de ADN molde, que permite multiplicar el ADN in vitro. ADN ligasas coser moléculas de ADN o reparar huecos en ellas. Endonucleasas de restricción, o enzimas de restricción, corta moléculas de ADN de acuerdo con secuencias estrictamente definidas, lo que permite cortar fragmentos individuales de la masa total de ADN. En algunos casos, estos fragmentos pueden contener genes individuales.

enzimas de restricción

Las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son simétricas y pueden ocurrir rupturas en el medio de dicha secuencia o con un desplazamiento (en el mismo lugar en ambas cadenas de ADN). Diagrama de acción diferentes tipos enzima de restricción se muestra en la Fig. 1. En el primer caso se obtienen los extremos denominados “romas”, y en el segundo caso, los extremos “pegajosos”. En el caso de los extremos "pegajosos" de la parte inferior, la cadena resulta ser más corta que la otra, y se forma una región monocatenaria con una secuencia simétrica, formada igual en ambos extremos.

Las secuencias terminales serán las mismas cuando cualquier ADN sea digerido por una enzima de restricción determinada y se podrán volver a unir porque tienen secuencias complementarias. Se pueden entrecruzar utilizando ADN ligasa para formar una sola molécula. De esta forma es posible combinar fragmentos de dos ADN diferentes y obtener el llamado ADN recombinante. Este enfoque se utiliza en el método de clonación molecular, que permite obtener genes individuales e introducirlos en células que pueden producir la proteína codificada en el gen.

clonación molecular

La clonación molecular utiliza dos moléculas de ADN: un inserto que contiene el gen de interés y vector- El ADN actúa como portador. El inserto se "cose" en el vector mediante enzimas, lo que produce una nueva molécula de ADN recombinante, luego esta molécula se introduce en las células huésped y estas células forman colonias en un medio nutritivo. Una colonia es la descendencia de una célula, es decir, un clon; todas las células de la colonia son genéticamente idénticas y contienen el mismo ADN recombinante. De ahí el término “clonación molecular”, es decir, la obtención de un clon de células que contiene el fragmento de ADN que nos interesa. Una vez obtenidas las colonias que contienen el inserto de interés, podemos varios métodos caracterizar esta inserción, por ejemplo, determinar su secuencia exacta. Las células también pueden producir la proteína codificada por el inserto si contiene un gen funcional.

Cuando se introduce una molécula recombinante en las células, se produce una transformación genética de estas células. Transformación- el proceso de absorción por una célula de un organismo de una molécula de ADN libre del medio ambiente y su integración en el genoma, lo que conduce a la aparición en dicha célula de nuevas características hereditarias características del organismo donante de ADN. Por ejemplo, si la molécula insertada contiene un gen de resistencia al antibiótico ampicilina, las bacterias transformadas crecerán en su presencia. Antes de la transformación, la ampicilina provocaba su muerte, es decir, aparece un nuevo rasgo en las células transformadas.

VECTORES

El vector debe tener una serie de propiedades:

En primer lugar, es una molécula de ADN relativamente pequeña, por lo que puede manipularse fácilmente.

En segundo lugar, para que el ADN se mantenga y se multiplique en una célula, debe contener una secuencia determinada, asegurando su replicación (el punto de origen de replicación, u origen de replicación).

En tercer lugar, debe contener gen marcador, lo que asegura la selección solo de aquellas células en las que ha entrado el vector. Por lo general, se trata de genes de resistencia a los antibióticos; luego, en presencia de un antibiótico, todas las células que no contienen el vector mueren.

La clonación de genes se realiza con mayor frecuencia en células bacterianas, ya que son fáciles de cultivar y se multiplican rápidamente. En una célula bacteriana suele haber una gran molécula circular de ADN, de varios millones de pares de nucleótidos, que contiene todos los genes necesarios para la bacteria: el cromosoma bacteriano. Además, en algunas bacterias hay un ADN circular pequeño (varios miles de pares de bases) llamado plásmidos(Figura 2). Ellos, como el ADN principal, contienen una secuencia de nucleótidos que asegura la capacidad del ADN para replicarse (ori). Los plásmidos se replican independientemente del ADN principal (cromosómico), por lo que están presentes en la célula en grandes cantidades copias Muchos de estos plásmidos portan genes de resistencia a los antibióticos, lo que permite distinguir las células que portan el plásmido de las células normales. Más a menudo, se utilizan plásmidos que portan dos genes que proporcionan resistencia a dos antibióticos, por ejemplo, tetraciclina y amicilina. Existir métodos simples aislamiento de dicho ADN plasmídico, libre del ADN del cromosoma principal de la bacteria.

EL SIGNIFICADO DE LA TRANGÉNESIS

La transferencia de genes de un organismo a otro se llama transgénesis, y tal organismos modificados - transgénico. El método de transferencia de genes a células microbianas produce preparaciones de proteínas recombinantes para necesidades médicas, en particular, proteínas humanas que no causan rechazo inmunológico: interferones, insulina y otras hormonas proteicas, factores de crecimiento celular y proteínas para la producción de vacunas. En casos más complejos, cuando la modificación de las proteínas se produce correctamente sólo en células eucariotas, se utilizan cultivos de células transgénicas o animales transgénicos, en particular ganado (principalmente cabras), que secretan las proteínas necesarias en la leche, o se aíslan proteínas de su sangre. Así se obtienen anticuerpos, factores de coagulación sanguínea y otras proteínas. El método de transgénesis produce plantas cultivadas que son resistentes a herbicidas y plagas y tienen otras propiedades beneficiosas. Purificación mediante microorganismos transgénicos aguas residuales y luchar contra la contaminación, existen incluso microbios transgénicos que pueden descomponer el petróleo. Además, las tecnologías transgénicas son indispensables en la investigación científica: el desarrollo de la biología hoy es impensable sin el uso rutinario de métodos de modificación y transferencia de genes.

tecnología de clonación molecular

inserciones

Para obtener un gen individual de un organismo, se aísla todo el ADN cromosómico y se divide con una o dos enzimas de restricción. Las enzimas se seleccionan de modo que no corten el gen que nos interesa, sino que hagan roturas a lo largo de sus bordes, y en el ADN del plásmido hagan 1 rotura en uno de los genes de resistencia, por ejemplo, a la ampicilina.

El proceso de clonación molecular incluye los siguientes pasos:

Cortar y unir es la construcción de una única molécula recombinante a partir de un inserto y un vector.

La transformación es la introducción de una molécula recombinante en las células.

La selección es la selección de células que recibieron un vector con un inserto.

cortar y coser

El ADN plasmídico se trata con las mismas enzimas de restricción y se convierte en una molécula lineal si se selecciona una enzima de restricción que introduce 1 ruptura en el plásmido. Como resultado, todos los fragmentos de ADN resultantes terminan con los mismos extremos pegajosos. Cuando la temperatura disminuye, estos extremos se conectan aleatoriamente y se entrecruzan con la ADN ligasa (ver Fig. 3).

Se obtiene una mezcla de ADN circular de diferente composición: algunos contendrán una determinada secuencia de ADN cromosómico conectado al ADN bacteriano, otros contendrán fragmentos de ADN cromosómico unidos entre sí, y otros contendrán un plásmido circular restaurado o su dímero ( Figura 4).

transformación

A continuación se realiza esta mezcla. transformación genética bacterias que no contienen plásmidos. Transformación- el proceso de absorción por una célula de un organismo de una molécula de ADN libre del medio ambiente y su integración en el genoma, lo que conduce a la aparición en dicha célula de nuevas características hereditarias características del organismo donante de ADN. Sólo un plásmido puede penetrar y multiplicarse en cada célula. Estas células se colocan en un medio nutritivo sólido que contiene el antibiótico tetraciclina. Las células que no han recibido el plásmido no crecerán en este medio y las células que portan el plásmido forman colonias, cada una de las cuales contiene los descendientes de una sola célula, es decir. todas las células de la colonia llevan el mismo plásmido (ver Fig. 5).

Selección

La siguiente tarea es aislar sólo las células que contienen el vector con el inserto y distinguirlas de las células que llevan sólo el vector sin el inserto o que no llevan el vector en absoluto. Este proceso de selección de las celdas deseadas se llama selección. Para ello utilizan marcadores selectivos- generalmente genes de resistencia a antibióticos en el vector, y medios selectivos, que contiene antibióticos u otras sustancias que proporcionan selección.

En el ejemplo que estamos considerando, las células de colonias cultivadas en presencia de ampicilina se subcultivan en dos medios: el primero contiene ampicilina y el segundo, tetraciclina. Las colonias que contienen sólo un plásmido crecerán en ambos medios, pero las colonias cuyos plásmidos contienen ADN cromosómico incrustado no crecerán en un medio con tetraciclina (Fig. 5). Entre ellos, mediante métodos especiales, se seleccionan aquellos que contienen el gen que nos interesa, se cultivan en cantidades suficientes y se aísla el ADN plasmídico. A partir de él, utilizando las mismas enzimas de restricción que se utilizaron para obtener ADN recombinante, se corta el gen individual de interés. El ADN de este gen se puede utilizar para determinar la secuencia de nucleótidos, introducirlo en cualquier organismo para obtener nuevas propiedades o sintetizar la proteína deseada. Este método de aislamiento de genes se llama clonación molecular.

PROTEÍNAS FLUORESCENTES

Es muy conveniente utilizar proteínas fluorescentes como genes marcadores en estudios de organismos eucariotas. El gen de la primera proteína fluorescente, proteína verde fluorescente (GFP) se aisló de la medusa Aqeuorea victoria y se introdujo en varios organismos modelo (ver Fig. 6). En 2008, O. Shimomura, M. Chalfie y R. Tsien recibieron el Premio Nobel por el descubrimiento y aplicación de esta proteína.

Luego se aislaron los genes de otras proteínas fluorescentes (roja, azul, amarilla). Estos genes han sido modificados artificialmente para producir proteínas con las propiedades deseadas. La diversidad de proteínas fluorescentes se muestra en la Fig. 7, que muestra una placa de Petri con bacterias que contienen genes para varias proteínas fluorescentes.

aplicación de proteínas fluorescentes

El gen de una proteína fluorescente se puede fusionar con el gen de cualquier otra proteína, luego, durante la traducción, se formará una sola proteína: una proteína de fusión traslacional, o fusión(proteína de fusión), que es fluorescente. De esta forma es posible estudiar, por ejemplo, la localización (ubicación) de posibles proteínas de interés en la célula y su movimiento. Al expresar proteínas fluorescentes solo en ciertos tipos de células, es posible marcar células de estos tipos en un organismo multicelular (ver Fig. 8 - cerebro de ratón, en el que las neuronas individuales tienen Colores diferentes debido a una determinada combinación de genes de proteínas fluorescentes). Proteínas fluorescentes - herramienta indispensable biología molecular moderna.

PCR

Otro método para obtener genes se llama reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se basa en la capacidad de las ADN polimerasas de completar la segunda hebra de ADN a lo largo de la hebra complementaria, como ocurre en las células durante la replicación del ADN.

Los orígenes de la replicación en este método están especificados por dos pequeños trozos de ADN llamados semillas, o cebadores. Estos cebadores son complementarios a los extremos del gen de interés en las dos cadenas de ADN. En primer lugar, el ADN cromosómico del que se debe aislar el gen se mezcla con cebadores y se calienta a 99 o C. Esto provoca la rotura de los enlaces de hidrógeno y la divergencia de las hebras de ADN. Después de eso, la temperatura se baja a 50-70 o C (dependiendo de la longitud y secuencia de las semillas). En estas condiciones, los cebadores se unen a regiones complementarias del ADN cromosómico, formando una doble hélice regular (ver Fig. 9). Después de esto, se agrega una mezcla de los cuatro nucleótidos necesarios para la síntesis de ADN y la ADN polimerasa. La enzima extiende los cebadores, construyendo ADN bicatenario a partir del sitio de unión de los cebadores, es decir. desde los extremos del gen hasta el final de la molécula cromosómica monocatenaria.

Si ahora vuelves a calentar la mezcla, las cadenas cromosómicas y recién sintetizadas se separarán. Después de enfriar, se les unirán nuevamente las semillas, que se toman en gran exceso (ver Fig. 10).

En las cadenas recién sintetizadas, no se unirán al extremo desde el que comenzó la primera síntesis, sino al extremo opuesto, ya que las cadenas de ADN son antiparalelas. Por tanto, en el segundo ciclo de síntesis, en dichas cadenas sólo se completará la secuencia correspondiente al gen (ver Fig. 11).

Este método utiliza ADN polimerasa de bacterias termófilas, que pueden resistir la ebullición y funcionan a temperaturas de 70-80 o C; no es necesario agregarlas cada vez, sino al comienzo del experimento; Repitiendo los procedimientos de calentamiento y enfriamiento en la misma secuencia, podemos duplicar el número de secuencias en cada ciclo, limitadas en ambos extremos por las semillas introducidas (ver Fig. 12).

Después de aproximadamente 25 ciclos de este tipo, el número de copias del gen aumentará más de un millón de veces. Estas cantidades pueden separarse fácilmente del ADN cromosómico añadido al tubo de ensayo y utilizarse para diversos fines.

secuencia ADN

Otro logro importante es el desarrollo de métodos para determinar la secuencia de nucleótidos en el ADN. secuencia ADN(de la secuencia inglesa - secuencia). Para ello, es necesario obtener genes puros de otro ADN utilizando uno de los métodos descritos. A continuación, las cadenas de ADN se separan calentando y se añade un cebador marcado con fósforo radiactivo o un marcador fluorescente. Tenga en cuenta que se toma una imprimación, complementaria a una hebra. Luego se añade la ADN polimerasa y una mezcla de 4 nucleótidos. Esta mezcla se divide en 4 partes y a cada una se le añade uno de los nucleótidos modificado para que el tercer átomo de la desoxirribosa no contenga un grupo hidroxilo. Si dicho nucleótido se incluye en la cadena de ADN que se está sintetizando, entonces su elongación no podrá continuar, porque la polimerasa no tendrá dónde unir el siguiente nucleótido. Por lo tanto, la síntesis de ADN se detiene después de la inclusión de dicho nucleótido. Estos nucleótidos, llamados didesoxinucleótidos, se agregan significativamente menos que los ordinarios, por lo que la terminación de la cadena ocurre solo ocasionalmente y en cada cadena en diferentes lugares. El resultado es una mezcla de cadenas de diferentes longitudes, cada una con el mismo nucleótido al final. Así, la longitud de la cadena corresponde al número de nucleótidos en la secuencia en estudio, por ejemplo, si tuviéramos un adenil didesoxinucleótido y las cadenas resultantes tuvieran una longitud de 2, 7 y 12 nucleótidos, entonces había adenina en las posiciones segunda, séptima y duodécima del gen. La mezcla de cadenas resultante se puede separar fácilmente por tamaño mediante electroforesis, y las cadenas sintetizadas se pueden identificar mediante radioactividad en una película de rayos X (ver Fig. 10).

El resultado es la imagen que se muestra en la parte inferior de la figura, llamada autógrafo. Moviéndolo de abajo hacia arriba y leyendo la letra sobre las columnas de cada zona, obtendremos la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura a la derecha del autógrafo. Resultó que la síntesis se detiene no sólo por didesoxinucleótidos, sino también por nucleótidos en los que algún grupo químico, por ejemplo un tinte fluorescente, está unido a la tercera posición del azúcar. Si cada nucleótido está marcado con su propio tinte, las zonas obtenidas al separar las cadenas sintetizadas brillarán con una luz diferente. Esto permite realizar la reacción en un tubo de ensayo simultáneamente para todos los nucleótidos y, dividiendo las cadenas resultantes por longitud, identificar los nucleótidos por color (ver Fig. 11).

Estos métodos permitieron determinar las secuencias no sólo de genes individuales, sino también leer genomas completos. Actualmente, se han desarrollado métodos aún más rápidos para determinar secuencias de nucleótidos en genes. Si el primer genoma humano fue descifrado por un gran consorcio internacional utilizando el primer método en 12 años, el segundo, utilizando el segundo, en tres años, ahora esto se puede hacer en un mes. Esto permite predecir la predisposición de una persona a muchas enfermedades y tomar medidas con anticipación para evitarlas.

La biología molecular ha experimentado un período desarrollo rápido propios métodos de investigación, que ahora difieren de la bioquímica. Estos incluyen, en particular, métodos de ingeniería genética, clonación, expresión artificial y eliminación de genes. Dado que el ADN es el portador material de la información genética, la biología molecular se ha acercado significativamente a la genética, y en la unión se formó la genética molecular, que es a la vez una rama de la genética y la biología molecular. Así como la biología molecular utiliza ampliamente los virus como herramienta de investigación, la virología utiliza métodos de biología molecular para resolver sus problemas. Para analizar la información genética utilizamos Ingeniería Informática, en relación con lo cual han surgido nuevas áreas de la genética molecular, que en ocasiones se consideran disciplinas especiales: bioinformática, genómica y proteómica.

Historia del desarrollo

Este descubrimiento fundamental fue fruto de un largo período de investigación sobre la genética y la bioquímica de virus y bacterias.

En 1928, Frederick Griffith demostró por primera vez que un extracto de bacterias patógenas muertas por calor podía transmitir patogenicidad a bacterias no peligrosas. El estudio de la transformación bacteriana condujo posteriormente a la purificación del agente patógeno que, contrariamente a lo esperado, resultó no ser una proteína, sino un ácido nucleico. El ácido nucleico en sí no es peligroso; sólo porta genes que determinan la patogenicidad y otras propiedades del microorganismo.

En los años 50 del siglo XX se demostró que las bacterias tienen un proceso sexual primitivo; son capaces de intercambiar ADN extracromosómico y plásmidos. El descubrimiento de los plásmidos, así como su transformación, formó la base de la tecnología de los plásmidos, muy extendida en la biología molecular. Otro descubrimiento importante para la metodología fue el descubrimiento de virus bacterianos y bacteriófagos a principios del siglo XX. Los fagos también pueden transferir material genético de una célula bacteriana a otra. La infección de bacterias por fagos provoca cambios en la composición del ARN bacteriano. Si sin fagos la composición del ARN es similar a la composición del ADN bacteriano, luego de la infección el ARN se vuelve más similar al ADN de un bacteriófago. Así, se estableció que la estructura del ARN está determinada por la estructura del ADN. A su vez, la tasa de síntesis de proteínas en las células depende de la cantidad de complejos de ARN-proteína. Así fue formulado dogma central de la biología molecular: ADN ↔ ARN → proteína.

El mayor desarrollo de la biología molecular estuvo acompañado tanto por el desarrollo de su metodología, en particular, la invención de un método para determinar la secuencia de nucleótidos del ADN (W. Gilbert y F. Sanger, Premio Nobel de Química 1980), como por nuevos descubrimientos. en el campo de la investigación sobre la estructura y funcionamiento de los genes (ver Historia de la genética). A comienzos del XXI siglo, se obtuvieron datos sobre la estructura primaria de todo el ADN humano y de varios otros organismos que son más importantes para la medicina. Agricultura y la investigación científica, que condujo al surgimiento de varias direcciones nuevas en biología: genómica, bioinformática, etc.

ver también

• Biología molecular (revista)
• Transcriptómica
• Paleontología molecular
• EMBO - Organización Europea de Biólogos Moleculares

Literatura

• Cantante M., Berg P. Genes y genomas. - Moscú, 1998.
• Stent G., Kalindar R. Genética molecular. - Moscú, 1981.
• Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Clonación molecular. - 1989.
• Patrushev L.I. La expresion genica. - M.: Nauka, 2000. - 000 p., enfermo. ISBN 5-02-001890-2

Enlaces

Fundación Wikimedia. 2010.

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• Distrito de Arzamas de la región de Nizhny Novgorod

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Libros

• Biología molecular de las células. Colección de problemas, J. Wilson, T. Hunt. El libro de autores estadounidenses es un apéndice de la segunda edición del libro de texto "Biología molecular de la célula" de B. Alberts, D. Bray, J. Lewis y otros. Contiene preguntas y tareas cuyo objetivo es profundizar. ..