Primijenjeni značaj molekularne biologije. Primijenjena molekularna biologija. Povijesni izlet u faze razvoja molekularne biologije

Molekularni biolog je medicinski istraživač čija je misija, ni manje ni više, spasiti čovječanstvo od opasnih bolesti. Među takvim bolestima, na primjer, onkologija, koja je danas postala jedan od glavnih uzroka smrtnosti u svijetu, samo malo inferiorna u odnosu na lidera - kardiovaskularne bolesti. Prioritet su nove metode za ranu dijagnostiku onkologije, prevenciju i liječenje raka moderna medicina. Molekularni biolozi u području onkologije razvijaju antitijela i rekombinantne (genetski modificirane) proteine ​​za ranu dijagnozu ili ciljanu dostavu lijeka u tijelo. Stručnjaci u ovom području koriste se najsuvremenijim dostignućima znanosti i tehnologije za stvaranje novih organizama i organskih tvari za njihovu daljnju upotrebu u istraživačkim i kliničkim aktivnostima. Među metodama koje koriste molekularni biolozi su kloniranje, transfekcija, infekcija, lančana reakcija polimerazom, sekvenciranje gena i druge. Jedna od tvrtki zainteresiranih za molekularne biologe u Rusiji je PrimeBioMed LLC. Organizacija se bavi proizvodnjom reagensa za antitijela za dijagnozu raka. Takva se antitijela uglavnom koriste za određivanje vrste tumora, njegovog porijekla i malignosti, odnosno sposobnosti metastaziranja (širenja na druge dijelove tijela). Protutijela se apliciraju na tanke dijelove tkiva koje se ispituje, nakon čega se u stanicama vežu za određene proteine ​​- markere koji su prisutni u tumorskim stanicama, ali ih nema u zdravim i obrnuto. Ovisno o rezultatima studije, propisano je daljnje liječenje. Među klijentima PrimeBioMeda nisu samo medicinske, već i znanstvene ustanove, budući da se antitijela mogu koristiti i za rješavanje istraživačkih problema. U takvim slučajevima mogu se proizvesti jedinstvena protutijela koja se mogu vezati na protein od interesa, pod konkretan zadatak posebnom narudžbom. Još nešto obećavajući pravac Istraživanje tvrtke usmjereno je na ciljanu isporuku lijekova u tijelu. U ovom slučaju, antitijela se koriste kao transport: uz njihovu pomoć, lijekovi se isporučuju izravno u zahvaćene organe. Tako liječenje postaje učinkovitije i ima manje negativnih posljedica za organizam od primjerice kemoterapije koja ne utječe samo na stanice raka, već i na druge stanice. Struka molekularni biolog u nadolazećim desetljećima očekuje se sve veća potražnja: s povećanjem prosječno trajanje Tijekom ljudskog života, broj bolesti raka će se povećavati. Rana dijagnoza tumora i inovativne metode liječenja pomoću tvari dobivenih od strane molekularnih biologa spasit će živote i poboljšati njihovu kvalitetu ogromnom broju ljudi.

Osnovno strukovno obrazovanje

Postoci odražavaju distribuciju stručnjaka s određenim stupnjem obrazovanja na tržištu rada. Ključne specijalizacije za svladavanje struke označene su zelenom bojom.

Sposobnosti i vještine

  • Sposobnost rukovanja reagensima, uzorcima, potrebno je znati raditi s malim predmetima
  • Vještine rada s velikom količinom informacija
  • Sposobnost rada rukama

Interesi i sklonosti

  • Želja za učenjem nečeg novog
  • Sposobnost multitaskinga (potrebno je pratiti tijek nekoliko reakcija i procesa istovremeno)
  • Točnost
  • Odgovornost (ne možete ostaviti posao "za sutra", jer se uzorci mogu oštetiti)
  • Skrupuloznost
  • naporan rad
  • Pažljivost (morate pratiti mikroprocese)

Profesija u osobama

Marija Šitova

Daria Samoilova

Aleksej Gračev

Molekularna biologija u području onkologije je perspektivan stručni smjer, budući da je borba protiv raka jedan od prioriteta svjetske medicine.

Molekularni biolozi su traženi u mnogim područjima zbog aktivnog razvoja znanosti, biotehnoloških i inovativnih poduzeća. Danas postoji blagi nedostatak stručnjaka, posebno onih s određenim iskustvom u svojoj specijalnosti. Do sada je prilično velik broj diplomanata i dalje odlazio na rad u inozemstvo. Mogućnosti za učinkovit rad na području biotehnologije u Rusiji sada se počinju pojavljivati, ali je prerano govoriti o masovnosti.

Posao molekularnog biologa zahtijeva aktivno sudjelovanje stručnjaka u znanstvenim aktivnostima, što postaje mehanizam za napredovanje u karijeri. Razvoj u struci moguć je kroz sudjelovanje u znanstvenim projektima i skupovima, a možda i kroz razvoj srodnih područja znanja. Također je u budućnosti moguć akademski razvoj od znanstvenog novaka preko znanstvenog novaka do vodećeg istraživača, profesora i/ili voditelja odjela/laboratorija.


intervju

Pirogov Sergey - sudionik priprema za Olimpijadu iz biologije koju je organizirao "Slon i žirafa" 2012.
Pobjednik Međunarodne univerzijade iz biologije
Pobjednik Olimpijade Lomonosov
Pobjednik regionalne etape Sveruska olimpijada iz biologije 2012
Studira na Moskovskom državnom sveučilištu. M.V. Lomonosova na Biološkom fakultetu: Zavod za molekularnu biologiju, 6. god.

Radi u laboratoriju biokemijske genetike životinja Instituta za molekularnu genetiku.

- Seryozha, ako čitatelji imaju pitanja, hoće li ih moći postaviti tebi?

Da, naravno, možete odmah postavljati pitanja. U ovom polju:

Kliknite da biste postavili pitanje.

- Krenimo od škole, nije se činilo da je tvoja škola super cool?

Studirao sam u vrlo slaboj školi u Moskvi, statistički prosječnoj srednjoj školi. Istina je da smo imali prekrasnu profesoricu MHC-a, zahvaljujući kojoj smo u mnogočemu imali nominalno usmjerenje škole “povijest umjetnosti”.

- Što je s biologijom?

Biologiju nam je predavala vrlo starija, pomalo gluha i opora žena, koje su se svi bojali.

Ali to nije dodalo ljubav njenoj temi. Biologija me fascinira od djetinjstva, od pete godine. Sve sam čitao, uglavnom me zanimaju anatomija i zoologija.


Tako su školski predmeti postojali paralelno s mojim vlastitim interesima. Olimpijske igre promijenile su sve.

- Reci mi više o ovome.

- Što se dogodilo u 9. razredu?

U 9. razredu nisam išao na okružnu pozornicu. Tamo sam neočekivano postigao slab, granični rezultat, za koji se pokazalo da ipak prolazi za regionalnu fazu. To je imalo snažnu motivacijsku snagu - svijest o tome koliko ja ne znam i koliko ljudi sve to zna (koliko takvih ljudi u nacionalnim razmjerima sam se čak bojao i zamisliti).

- Reci mi kako si se pripremio.

Intenzivno samostalno učenje, pohodi po knjižarama i tisuće prošlogodišnjih zadataka djelovali su ljekovito. Dobila sam jedan od najviših bodova za teoriju (što je za mene također bilo potpuno neočekivano), otišla na praktičnu fazu... i pala. Tada nisam ni znao za postojanje praktične pozornice.

- Jesu li Olimpijske igre utjecale na vas?

Život mi se radikalno promijenio. Saznao sam za mnoge druge olimpijade, a posebno sam se zaljubio u ShBO.

Kasnije je na mnogima pokazao dobre rezultate, neke je osvojio, a zahvaljujući Lomonosovskoj dobio je pravo na upis bez ispita. Paralelno sam pobjeđivao na olimpijadama iz povijesti umjetnosti za koje i danas dišem neravnomjerno. Istina, nikad nisam bio prijatelj s praktičnim turama. U 11. razredu konačno sam došao do završne faze, ali sreća nije bila naklonjena i ovaj put nisam stigao ispuniti matricu odgovora za teoretsku fazu. Ali to mi je omogućilo da više ne brinem previše o praktičnim stvarima.

- Jeste li upoznali mnogo olimpijaca?


Da, i dalje smatram da sam imao veliku sreću s krugom svojih vršnjaka koji su mi uvelike proširili vidike. Druga strana olimpijada, osim motivacije da se predmet proučava skladnije, bilo je upoznavanje sa sudionicima olimpijade. Već tada sam primijetio da je horizontalna komunikacija ponekad korisnija od vertikalne – s učiteljima na treninzima.

Nakon 11. razreda upisao sam biološki odsjek Moskovskog državnog sveučilišta. Većina mojih tadašnjih drugova odlučila se za FBB, ali ovdje je primarnu ulogu odigrala činjenica da nisam postao sveruski pobjednik.

To znači da bih morao položiti interni ispit iz matematike, ali u njemu, pogotovo u školskoj matematici - višu sam matematiku volio puno više - nisam bio jak. I bilo je jako malo priprema u školi (nismo čak bili pripremljeni za skoro cijeli C dio).

Što se tiče interesa, već tada sam slutio da je u konačnici moguće postići bilo kakav rezultat, bez obzira na mjesto upisa. Naknadno se pokazalo da ima dosta diplomanata FBB-a koji su se prebacili na pretežno vlažnu biologiju, i obrnuto – mnogi dobri bioinformatičari krenuli su kao amateri. Iako mi se u tom trenutku činilo da će kontingent na biologiji biti puno slabiji od FBB-a. Sigurno sam pogriješio u vezi ovoga.

To znači da bih morao položiti interni ispit iz matematike, ali u njemu, pogotovo u školskoj matematici - višu sam matematiku volio puno više - nisam bio jak. I bilo je jako malo priprema u školi (nismo čak bili pripremljeni za skoro cijeli C dio).

Što se tiče interesa, već tada sam slutio da je u konačnici moguće postići bilo kakav rezultat, bez obzira na mjesto upisa. Naknadno se pokazalo da ima dosta diplomanata FBB-a koji su se prebacili na pretežno vlažnu biologiju, i obrnuto – mnogi dobri bioinformatičari krenuli su kao amateri. Iako mi se u tom trenutku činilo da će kontingent na biologiji biti puno slabiji od FBB-a. Sigurno sam pogriješio u vezi ovoga.

jeste li znali

Zanimljiv

U kampu Elephant and Giraffe postoje pomaci u biokemiji i molekularnoj biologiji, gdje školarci, zajedno s iskusnim učiteljima s Moskovskog državnog sveučilišta, provode eksperimente i pripremaju se za olimpijade. / © Intervju vodio Denis Reshetov. Fotografije je ljubazno ustupio Sergej Pirogov. Molekularna biologijaɛ məlʊ Molekularna biologijaDo / J ər je grana biologije koja se bavi molekularnom osnovom biološke aktivnosti između biomolekula u raznih sustava stanica, uključujući interakcije između DNA, RNA, proteina i njihove biosinteze, kao i regulaciju tih interakcija. Prijavite se za

priroda 1961. Astbury je opisao molekularnu biologiju: Ne toliko tehnika koliko pristup, pristup sa stajališta takozvanih temeljnih znanosti s vodećom idejom traženja ispod velikih manifestacija klasične biologije za odgovarajuću molekularnu ravan. On se posebno bavi

oblicima

bioloških molekula i [...] pretežno trodimenzionalnih i strukturnih – što međutim ne znači da je riječ samo o doradi morfologije. On mora istodobno istražiti postanak i funkcije.

  • Odnos prema drugim biološkim znanostima je proučavanje kemikalija i vitalnih procesa koji se odvijaju u živim organizmima. Biokemičari se teško usredotočuju na ulogu, funkciju i strukturu biomolekula. Proučavanje kemije koja stoji iza bioloških procesa i sinteza biološki aktivnih molekula primjeri su biokemije.
  • Genetika je proučavanje utjecaja genetskih razlika u organizmima. To se često može zaključiti prema odsutnosti normalne komponente (npr. jednog gena). Proučavanje "mutanata" su organizmi koji imaju jednu ili više funkcionalnih komponenti u odnosu na takozvani "divlji tip" ili normalni fenotip. Genetske interakcije (epistaza) često zbunjuju jednostavna tumačenja takvih "nokaut" studija.
  • U kampu Elephant and Giraffe postoje pomaci u biokemiji i molekularnoj biologiji, gdje školarci, zajedno s iskusnim učiteljima s Moskovskog državnog sveučilišta, provode eksperimente i pripremaju se za olimpijade. je proučavanje molekularne osnove procesa replikacije, transkripcije, translacije i funkcije stanice. Središnja dogma molekularne biologije, gdje se genetski materijal prepisuje u RNK i zatim prevodi u protein, iako previše pojednostavljena, još uvijek pruža dobro polazište za razumijevanje ovog područja. Slika je revidirana u svjetlu pojavljivanja novih uloga za RNA.

Metode molekularne biologije

Molekularno kloniranje

Jedna od najosnovnijih tehnika molekularne biologije za proučavanje funkcije proteina je molekularno kloniranje. U ovoj tehnici, DNA koja kodira protein od interesa klonira se pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili restrikcijskih enzima u plazmid (ekspresijski vektor). Vektor ima 3 razlikovna obilježja: podrijetlo replikacije, mjesto višestrukog kloniranja (MCS) i selektivni marker, obično za otpornost na antibiotike. Uzvodno od mjesta višestrukog kloniranja nalaze se regije promotora i mjesta početka transkripcije koje reguliraju ekspresiju kloniranog gena. Ovaj plazmid se može umetnuti u bakterijske ili životinjske stanice. Uvođenje DNA u bakterijske stanice može se izvršiti transformacijom preuzimanjem gole DNA, konjugacijom kontaktom stanica-stanica ili transdukcijom virusnim vektorom. Uvođenje DNA u eukariotske stanice, kao što su životinjske stanice, korištenjem fizičkih ili kemikalije, naziva se transfekcija. Dostupno je nekoliko različitih metoda transfekcije, kao što su transfekcija kalcijevim fosfatom, elektroporacija, mikroinjekcija i liposomska transfekcija. Plazmid se može integrirati u genom, što rezultira stabilnom transfekcijom, ili može ostati neovisan o genomu, što se naziva tranzijentima transfekcije.

DNK koja kodira proteine ​​od interesa sada je unutar stanice i proteini se sada mogu eksprimirati. Razni sustavi kao što su inducibilni promotori i specifični faktori stanične signalizacije koji će pomoći u izražavanju interesa za proteine visoke razine. Velike količine Proteini se zatim mogu ekstrahirati iz bakterijske ili eukariotske stanice. Protein se može testirati na enzimsku aktivnost u različitim situacijama, protein se može kristalizirati tako da se može proučavati njegova tercijarna struktura ili, u farmaceutskoj industriji, može se proučavati aktivnost novih lijekova protiv proteina.

Lančana reakcija polimerazom

Blotiranje i istraživanje makromolekula

Uvjeti sjeverni , Zapad I orijentalni blotting potječe od onoga što je izvorno bila šala o molekularnoj biologiji koja se igrala na pojam Southernnet, slijedeći tehniku ​​koju je opisao Edwin Southern za BLOTTED DNA hibridizaciju. Patricia Thomas, programer RNA blottinga, koji je tada postao poznat kao sjeverni - upijanje, nemoj baš koristiti taj izraz.

Southern blotting

Nazvan po svom izumitelju, biologu Edwinu Southernu, Southern blot je metoda za testiranje prisutnosti specifične sekvence DNK u uzorku DNK. Uzorci DNK prije ili nakon probave restrikcijskim enzimom (restrikcijskim enzimom) odvajaju se elektroforezom u gelu i zatim prenose na membranu upijanjem pomoću kapilarnog djelovanja. Membrana se tada izlaže obilježenoj DNA probi, koja ima baznu sekvencu komplementarnu sekvenci na DNA od interesa. Southern blotting manje se koristi u znanstvenom laboratoriju zbog mogućnosti drugih metoda, kao što je PCR, da otkriju specifične sekvence DNK iz uzoraka DNK. Međutim, te se mrlje još uvijek koriste za neke primjene, kao što je mjerenje broja kopija transgena kod transgenih miševa ili u genetskom inženjeringu izbačenih linija embrionalnih matičnih stanica.

Northern blotting

Northern blot dijagram

Eastern blot

Kliničke studije i medicinske metode tretmani koji proizlaze iz molekularne biologije djelomično su pokriveni genskom terapijom. Primjena pristupa molekularne biologije ili molekularne stanične biologije u medicini danas se naziva molekularna medicina. Molekularna biologija također igra ulogu važnu ulogu u razumijevanju obrazovanja, djelovanja i propisa razne dijelove stanice koje se mogu koristiti za učinkovito ciljanje novih lijekova, dijagnosticiranje bolesti i razumijevanje stanične fiziologije.

dalje čitanje

  • Cohen, S.N., Chang, N.K.D., Boyer, H. & Heling, R.B. Konstrukcija biološki funkcionalnih bakterijskih plazmida in vitro .

Napredak u proučavanju nukleinskih kiselina i biosinteze proteina doveo je do stvaranja niza metoda od velikog primjenjivog značaja u medicini, poljoprivredi i nizu drugih industrija.

Nakon proučavanja genetskog koda i temeljnih principa pohranjivanja i implementacije nasljednih informacija, razvoj molekularne biologije je stao, jer nije bilo metoda koje su omogućavale manipuliranje genima, njihovu izolaciju i promjenu. Pojava ovih metoda dogodila se 1970-1980-ih. To je dalo snažan poticaj razvoju ovog područja znanosti koje i danas cvjeta. Prije svega, to se metode odnose na dobivanje pojedinačnih gena i njihovo uvođenje u stanice drugih organizama (molekularno kloniranje i transgeneza, PCR), kao i metode za određivanje slijeda nukleotida u genima (DNA i RNA sekvenciranje). U nastavku će se detaljnije raspravljati o ovim metodama. Započet ćemo s najjednostavnijom osnovnom metodom - elektroforezom, a zatim prijeći na složenije metode.

ELEKTROFOREZA DNA

Ovo je osnovna metoda rada s DNK, koja se koristi u kombinaciji s gotovo svim drugim metodama za izolaciju željenih molekula i analizu rezultata. Gel elektroforeza se koristi za razdvajanje fragmenata DNK po duljini. DNA je kiselina; njezine molekule sadrže ostatke fosforne kiseline, koji uklanjaju proton i dobivaju negativan naboj (slika 1).

Stoga, u električno polje Molekule DNA kreću se prema anodi – pozitivno nabijenoj elektrodi. To se događa u otopini elektrolita koja sadrži ione koji nose naboj, zbog čega otopina provodi struju. Za odvajanje fragmenata koristi se gusti gel od polimera (agaroza ili poliakrilamid). Molekule DNK se u nju “zapliću” što su dulje, pa se stoga najduže molekule kreću najsporije, a najkraće najbrže (slika 2). Prije ili nakon elektroforeze gel se tretira bojama koje se vežu za DNA i fluoresciraju na ultraljubičastom svjetlu te se dobije uzorak traka u gelu (vidi sliku 3). Da bi se odredile duljine fragmenata uzorka DNA, oni se uspoređuju s markerom - skupom fragmenata standardne duljine paralelno nanesenih na isti gel (slika 4).

Najvažniji alati za rad s DNA su enzimi koji provode transformacije DNA u živim stanicama: DNA polimeraze, DNA ligaze i restrikcijske endonukleaze, odnosno restriktaze. DNA polimeraze provode sintezu DNA predložaka, što omogućuje umnožavanje DNA in vitro. DNA ligaze sašiti molekule DNK zajedno ili zaliječiti praznine u njima. Restrikcijske endonukleaze, ili restrikcijskih enzima, režu molekule DNA prema strogo definiranim sekvencama, što omogućuje izrezivanje pojedinačnih fragmenata iz ukupne mase DNA. Ti fragmenti mogu u nekim slučajevima sadržavati pojedinačne gene.

restrikcijskih enzima

Sekvence koje restrikcijski enzimi prepoznaju su simetrične, a do prekida može doći u sredini takve sekvence ili s pomakom (na istom mjestu u oba lanca DNK). Akcijski dijagram različite vrste restrikcijski enzim prikazan je na sl. 1. U prvom slučaju dobivaju se takozvani “tupi” krajevi, a u drugom slučaju “ljepljivi” krajevi. U slučaju "ljepljivih" krajeva dna, ispada da je lanac kraći od drugog, a formira se jednolančana regija sa simetričnim nizom, jednakim na oba formirana kraja.

Završne sekvence bit će iste kada se bilo koja DNK probavi danim restrikcijskim enzimom i mogu se ponovno spojiti jer imaju komplementarne sekvence. Oni se mogu umrežiti korištenjem DNA ligaze kako bi formirali jednu molekulu. Na taj način moguće je spojiti fragmente dviju različitih DNK i dobiti tzv rekombinantna DNA. Ovaj se pristup koristi u metodi molekularnog kloniranja, koja omogućuje dobivanje pojedinačnih gena i uvođenje u stanice koje mogu stvarati protein kodiran u genu.

molekularno kloniranje

Molekularno kloniranje koristi dvije molekule DNK - umetak koji sadrži gen od interesa i vektor- DNK koja djeluje kao prijenosnik. Umetak se pomoću enzima „ušije“ u vektor, pri čemu nastaje nova, rekombinantna molekula DNA, zatim se ta molekula unosi u stanice domaćina, a te stanice stvaraju kolonije na hranjivoj podlozi. Kolonija je potomak jedne stanice, odnosno klon; sve stanice kolonije su genetski identične i sadrže istu rekombinantnu DNK. Otuda i izraz "molekularno kloniranje", odnosno dobivanje klona stanica koje sadrže fragment DNA koji nas zanima. Nakon što se dobiju kolonije koje sadrže umetak od interesa, možemo razne metode okarakterizirati ovo umetanje, na primjer, odrediti njegov točan redoslijed. Stanice također mogu proizvoditi protein kodiran umetkom ako sadrži funkcionalni gen.

Kada se rekombinantna molekula uvede u stanice, dolazi do genetske transformacije tih stanica. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoline i njezine integracije u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih karakteristika karakterističnih za organizam donora DNA. Na primjer, ako umetnuta molekula sadrži gen za otpornost na antibiotik ampicilin, tada će transformirane bakterije rasti u njegovoj prisutnosti. Prije transformacije ampicilin je uzrokovao njihovu smrt, odnosno u transformiranim stanicama javlja se novo svojstvo.

VEKTORI

Vektor mora imati niz svojstava:

    Prvo, to je relativno mala molekula DNK pa se njome može lako manipulirati.

    Drugo, da bi se DNK održala i umnožila u stanici, ona mora sadržavati određeni slijed, osiguravajući njegovu replikaciju (točka podrijetla replikacije ili ishodište replikacije).

    Treće, mora sadržavati markerski gen, koji osigurava odabir samo onih stanica u koje je vektor ušao. Obično su to geni otporni na antibiotike – tada u prisutnosti antibiotika umiru sve stanice koje ne sadrže vektor.

Kloniranje gena najčešće se provodi u bakterijskim stanicama jer se one lako uzgajaju i brzo razmnožavaju. U bakterijskoj stanici obično postoji jedna velika kružna molekula DNA, duga nekoliko milijuna parova nukleotida, koja sadrži sve gene potrebne bakterijama - bakterijski kromosom. Osim nje, u nekim bakterijama postoji mala (nekoliko tisuća parova baza) kružna DNA tzv. plazmidi(slika 2). Oni, poput glavne DNA, sadrže nukleotidnu sekvencu koja osigurava sposobnost replikacije DNA (ori). Plazmidi se repliciraju neovisno o glavnoj (kromosomskoj) DNA, stoga su prisutni u stanici u velike količine kopije Mnogi od ovih plazmida nose gene otpornosti na antibiotike, što omogućuje razlikovanje stanica koje nose plazmid od normalnih stanica. Češće se koriste plazmidi koji nose dva gena koji pružaju otpornost na dva antibiotika, na primjer, tetraciklin i amicilin. postoje jednostavne metode izolacija takve plazmidne DNA, slobodne od DNA glavnog kromosoma bakterije.

ZNAČAJ TRANGENEZE

Prijenos gena iz jednog organizma u drugi naziva se transgeneza, i slično modificirani organizmi - transgenski. Metodom prijenosa gena u mikrobne stanice dobivaju se rekombinantni proteinski pripravci za medicinske potrebe, posebice ljudski proteini koji ne izazivaju imunološko odbacivanje - interferoni, inzulin i drugi proteinski hormoni, stanični faktori rasta, kao i proteini za proizvodnju cjepiva. U složenijim slučajevima, kada se modifikacija proteina pravilno odvija samo u eukariotskim stanicama, koriste se kulture transgenih stanica ili transgene životinje, posebice stoka (prvenstveno koze), koja izlučuje potrebne proteine ​​u mlijeko ili se proteini izoliraju iz njihove krvi. Tako se dobivaju antitijela, faktori zgrušavanja krvi i druge bjelančevine. Metodom transgeneze dobivaju se kultivirane biljke koje su otporne na herbicide i štetnike te imaju druge korisna svojstva. Pročišćavanje pomoću transgenih mikroorganizama otpadne vode i bore se protiv zagađenja, postoje čak i transgeni mikrobi koji mogu razgraditi naftu. Osim toga, transgene tehnologije nezamjenjive su u znanstvenim istraživanjima – razvoj biologije danas je nezamisliv bez rutinske primjene metoda modifikacije i prijenosa gena.

tehnologija molekularnog kloniranja

umetci

Da bi se dobio pojedinačni gen iz organizma, iz njega se izolira sva kromosomska DNA i razdvoji s jednim ili dva restrikcijska enzima. Enzimi su odabrani tako da ne sijeku gen koji nas zanima, već prave prekide duž njegovih rubova, au plazmidnoj DNA naprave 1 prekid u jednom od gena za rezistenciju, na primjer, na ampicilin.

Proces molekularnog kloniranja uključuje sljedeće korake:

    Rezanje i spajanje je konstrukcija jedne rekombinantne molekule iz umetka i vektora.

    Transformacija je uvođenje rekombinantne molekule u stanice.

    Selekcija je selekcija ćelija koje su primile vektor s umetkom.

rezanje i šivanje

Plazmidna DNA se tretira istim restrikcijskim enzimima, te se pretvara u linearnu molekulu ako se odabere restrikcijski enzim koji uvodi 1 prekid u plazmid. Kao rezultat toga, svi nastali fragmenti DNK završavaju s istim ljepljivim krajevima. Kada se temperatura smanji, ovi krajevi su nasumično povezani i umreženi su DNA ligazom (vidi sliku 3).

Dobije se mješavina kružne DNA različitog sastava: neke od njih će sadržavati određenu DNA sekvencu kromosomske DNA povezane s bakterijskom DNA, druge će sadržavati spojene fragmente kromosomske DNA, a treće će sadržavati obnovljeni kružni plazmid ili njegov dimer ( Slika 4).

transformacija

Zatim se ova smjesa izvodi genetska transformacija bakterije koje ne sadrže plazmide. Transformacija- proces apsorpcije stanice organizma slobodne molekule DNA iz okoline i njezine integracije u genom, što dovodi do pojave u takvoj stanici novih nasljednih karakteristika karakterističnih za organizam donora DNA. Samo jedan plazmid može prodrijeti i umnožiti se u svakoj stanici. Takve se stanice stavljaju na čvrsti hranjivi medij koji sadrži antibiotik tetraciklin. Stanice koje nisu primile plazmid neće rasti na ovoj podlozi, a stanice koje nose plazmid formiraju kolonije od kojih svaka sadrži potomke samo jedne stanice, tj. sve stanice u koloniji nose isti plazmid (vidi sliku 5).

Izbor

Sljedeći zadatak je izolirati samo stanice koje sadrže vektor s umetkom, te ih razlikovati od stanica koje nose samo vektor bez umetka ili uopće ne nose vektor. Ovaj postupak odabira željenih ćelija naziva se izbor. U tu svrhu koriste selektivni markeri- obično geni otporni na antibiotike u vektoru, i selektivni mediji, koji sadrži antibiotike ili druge tvari koje omogućuju selekciju.

U primjeru koji razmatramo, stanice iz kolonija uzgojenih u prisutnosti ampicilina subkultivirane su u dva medija: prvi sadrži ampicilin, a drugi sadrži tetraciklin. Kolonije koje sadrže samo plazmid će rasti na oba medija, ali kolonije čiji plazmidi sadrže ugrađenu kromosomsku DNA neće rasti na mediju s tetraciklinom (slika 5). Među njima se posebnim metodama odabiru oni koji sadrže gen koji nas zanima, uzgajaju se u dovoljnim količinama i izdvaja plazmidna DNA. Iz njega se, korištenjem istih restrikcijskih enzima koji su korišteni za dobivanje rekombinantne DNA, izrezuje pojedinačni gen od interesa. DNK ovog gena može se koristiti za određivanje sekvence nukleotida, uvođenje u bilo koji organizam za dobivanje novih svojstava ili sintetiziranje željenog proteina. Ova metoda izolacije gena naziva se molekularno kloniranje.

FLUORESCENTNI PROTEINI

Vrlo je zgodno koristiti fluorescentne proteine ​​kao markerske gene u studijama eukariotskih organizama. Gen za prvi fluorescentni protein, zeleni fluorescentni protein (GFP) je izoliran iz meduze Aqeuorea victoria i uveden u različite modelne organizme (vidi sliku 6). Godine 2008. O. Shimomura, M. Chalfie i R. Tsien dobili su Nobelovu nagradu za otkriće i primjenu ovog proteina.

Zatim su izolirani geni drugih fluorescentnih proteina - crvene, plave, žute. Ovi geni su umjetno modificirani za proizvodnju proteina sa željenim svojstvima. Raznolikost fluorescentnih proteina prikazana je na Sl. 7, koja prikazuje Petrijevu zdjelicu s bakterijama koje sadrže gene za razne fluorescentne proteine.

primjena fluorescentnih proteina

Gen fluorescentnog proteina može se spojiti s genom bilo kojeg drugog proteina, tada će tijekom translacije nastati jedan protein - translacijski fuzijski protein, ili fuzija(fuzijski protein), koji fluorescira. Na taj je način moguće proučavati, primjerice, lokalizaciju (položaj) bilo kojih proteina od interesa u stanici i njihovo kretanje. Ekspresijom fluorescentnih proteina samo u određenim tipovima stanica, moguće je označiti stanice tih tipova u višestaničnom organizmu (vidi sliku 8 - mišji mozak, u kojem pojedini neuroni imaju različite boje zbog određene kombinacije gena fluorescentnih proteina). Fluorescentni proteini - neizostavan alat moderna molekularna biologija.

PCR

Druga metoda dobivanja gena tzv lančana reakcija polimerazom (PCR). Temelji se na sposobnosti DNA polimeraza da dovrše drugi lanac DNA duž komplementarnog lanca, kao što se događa u stanicama tijekom replikacije DNA.

Počeci replikacije u ovoj metodi određeni su dvama malim komadićima DNA tzv sjemenke, ili početnice. Ti su početnici komplementarni krajevima gena od interesa na dva lanca DNA. Najprije se kromosomska DNA iz koje se mora izolirati gen pomiješa s početnicama i zagrije na 99 o C. To dovodi do kidanja vodikovih veza i divergencije DNA lanaca. Nakon toga temperatura se snižava na 50-70 o C (ovisno o dužini i redoslijedu sjemena). Pod tim uvjetima, početnice se pričvršćuju na komplementarne regije kromosomske DNA, tvoreći pravilnu dvostruku spiralu (vidi sliku 9). Nakon toga se dodaje mješavina sva četiri nukleotida potrebna za sintezu DNA i DNA polimeraze. Enzim proširuje početnice, gradeći dvolančanu DNA od mjesta vezanja početnica, tj. od krajeva gena do kraja jednolančane kromosomske molekule.

Ako sada ponovno zagrijemo smjesu, kromosomski i novosintetizirani lanac će se razdvojiti. Nakon hlađenja, ponovno će im se pridružiti sjemenke, koje se uzimaju u velikom višku (vidi sliku 10).

Na novosintetiziranim lancima oni se neće spajati na kraj s kojeg je započela prva sinteza, već na suprotni kraj, budući da su lanci DNA antiparalelni. Stoga će u drugom ciklusu sinteze samo sekvenca koja odgovara genu biti dovršena na takvim lancima (vidi sliku 11).

Ova metoda koristi DNA polimerazu iz termofilnih bakterija, koja može izdržati kuhanje i djeluje na temperaturama od 70-80 o C, ne treba je dodavati svaki put, već je potrebno dodati na početku eksperimenta. Ponavljanjem postupaka zagrijavanja i hlađenja u istom nizu, možemo udvostručiti broj nizova u svakom ciklusu, ograničen na oba kraja unesenim sjemenkama (vidi sliku 12).

Nakon otprilike 25 takvih ciklusa, broj kopija gena povećat će se više od milijun puta. Takve se količine mogu lako odvojiti od kromosomske DNA dodane u epruvetu i koristiti u razne svrhe.

Sekvenciranje DNA

Drugo važno postignuće je razvoj metoda za određivanje slijeda nukleotida u DNA - Sekvenciranje DNA(iz engleskog slijeda - slijed). Za to je potrebno dobiti čiste gene iz druge DNK pomoću jedne od opisanih metoda. Lanci DNK se zatim odvajaju zagrijavanjem i dodaje se početnica obilježena radioaktivnim fosforom ili fluorescentna oznaka. Imajte na umu da se uzima jedan primer, komplementaran jednom pramenu. Zatim se dodaje DNA polimeraza i smjesa od 4 nukleotida. Ova smjesa se podijeli na 4 dijela i svakom se doda po jedan od nukleotida, modificiran tako da treći atom deoksiriboze ne sadrži hidroksilnu skupinu. Ako je takav nukleotid uključen u lanac DNA koji se sintetizira, tada se njegovo produljenje neće moći nastaviti, jer polimeraza neće imati kamo pričvrstiti sljedeći nukleotid. Stoga se sinteza DNA zaustavlja nakon uključivanja takvog nukleotida. Takvih nukleotida, zvanih dideoksinukleotidi, dodaje se znatno manje od običnih, pa do prekida lanca dolazi samo povremeno i to u svakom lancu u različita mjesta. Rezultat je mješavina lanaca različitih duljina, svaki s istim nukleotidom na kraju. Dakle, duljina lanca odgovara broju nukleotida u nizu koji se proučava, na primjer, ako smo imali adenil dideoksinukleotid, a dobiveni lanci su imali duljinu od 2, 7 i 12 nukleotida, tada je u njemu bio adenin drugo, sedmo i dvanaesto mjesto u genu. Dobivena smjesa lanaca može se lako razdvojiti po veličini pomoću elektroforeze, a sintetizirani lanci mogu se identificirati radioaktivnošću na rendgenskom filmu (vidi sliku 10).

Rezultat je slika prikazana na dnu figure, koja se naziva autogram. Krećući se njime odozdo prema gore i čitajući slovo iznad stupaca svake zone, dobit ćemo niz nukleotida prikazan na slici desno od autograma. Pokazalo se da sintezu zaustavljaju ne samo dideoksinukleotidi, već i nukleotidi u kojima je neka kemijska skupina, primjerice fluorescentna boja, vezana na treću poziciju šećera. Ako je svaki nukleotid obilježen vlastitom bojom, tada će zone dobivene odvajanjem sintetiziranih lanaca svijetliti drugačijim svjetlom. To omogućuje provođenje reakcije u jednoj epruveti istovremeno za sve nukleotide i, dijeleći dobivene lance po duljini, identificirati nukleotide po boji (vidi sliku 11).

Takve su metode omogućile određivanje sekvenci ne samo pojedinačnih gena, već i čitanje cijelih genoma. Trenutno su razvijene još brže metode za određivanje nukleotidnih sekvenci u genima. Ako je prvi ljudski genom veliki međunarodni konzorcij dešifrirao prvom zadanom metodom za 12 godina, drugi, drugom, za tri godine, sada se to može učiniti za mjesec dana. To omogućuje predviđanje predispozicije osobe za mnoge bolesti i poduzimanje mjera unaprijed za njihovo izbjegavanje.

Molekularna biologija je proživjela razdoblje brz razvoj vlastite metode istraživanja, koje se sada razlikuju od biokemije. To posebice uključuje metode genetskog inženjeringa, kloniranja, umjetne ekspresije i nokauta gena. Budući da je DNK materijalni nositelj genetske informacije, molekularna biologija se znatno približila genetici, a na spoju je nastala molekularna genetika, koja je grana genetike i molekularne biologije. Baš kao što molekularna biologija naširoko koristi viruse kao istraživački alat, virologija koristi metode molekularne biologije za rješavanje svojih problema. Za analizu genetskih informacija koristimo se računalne tehnologije, u vezi s kojim su nastala nova područja molekularne genetike, koja se ponekad smatraju posebnim disciplinama: bioinformatika, genomika i proteomika.

Povijest razvoja

Ovo ključno otkriće pripremljeno je dugim razdobljem istraživanja genetike i biokemije virusa i bakterija.

Godine 1928. Frederick Griffith prvi je pokazao da ekstrakt patogenih bakterija ubijenih toplinom može prenijeti patogenost na neopasne bakterije. Proučavanje bakterijske transformacije kasnije je dovelo do pročišćavanja patogena, za koji se, suprotno očekivanjima, pokazalo da nije protein, već nukleinska kiselina. Sama nukleinska kiselina nije opasna, ona samo nosi gene koji određuju patogenost i druga svojstva mikroorganizma.

U 50-im godinama 20. stoljeća pokazalo se da bakterije imaju primitivan spolni proces; sposobne su izmjenjivati ​​ekstrakromosomsku DNA i plazmide. Otkriće plazmida, kao i transformacija, činili su osnovu plazmidne tehnologije, raširene u molekularnoj biologiji. Drugo važno otkriće za metodologiju bilo je otkriće bakterijskih virusa i bakteriofaga početkom 20. stoljeća. Fagi također mogu prenijeti genetski materijal iz jedne bakterijske stanice u drugu. Infekcija bakterija fagima dovodi do promjena u sastavu bakterijske RNA. Ako je bez faga sastav RNA sličan sastavu bakterijske DNA, tada nakon infekcije RNA postaje sličnija DNA bakteriofaga. Tako je utvrđeno da je struktura RNK određena strukturom DNK. S druge strane, brzina sinteze proteina u stanicama ovisi o količini kompleksa RNA-protein. Ovako je to formulirano središnja dogma molekularne biologije: DNA ↔ RNA → protein.

Daljnji razvoj molekularne biologije bio je popraćen kako razvojem njezine metodologije, posebice izumom metode za određivanje nukleotidnog slijeda DNA (W. Gilbert i F. Sanger, Nobelova nagrada za kemiju 1980.), tako i novim otkrićima. u području istraživanja strukture i funkcioniranja gena (vidi Povijest genetike). DO početak XXI stoljeća, dobiveni su podaci o primarnoj strukturi cjelokupne ljudske DNA i niza drugih organizama koji su najvažniji za medicinu, poljoprivreda i znanstvenog istraživanja, što je dovelo do pojave nekoliko novih pravaca u biologiji: genomika, bioinformatika i dr.

Vidi također

  • Molecular Biology (časopis)
  • Transkriptomika
  • Molekularna paleontologija
  • EMBO - Europska organizacija molekularnih biologa

Književnost

  • Pjevač M., Berg P. Geni i genomi. - Moskva, 1998.
  • Stent G., Kalindar R. Molekularna genetika. - Moskva, 1981.
  • Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molekularno kloniranje. - 1989. (prikaz).
  • Patrušev L. I. Ekspresija gena. - M.: Nauka, 2000. - 000 str., ilustr. ISBN 5-02-001890-2

Linkovi


Zaklada Wikimedia.

  • 2010.
  • Okrug Ardatovsky, regija Nižnji Novgorod

Okrug Arzamas regije Nižnji Novgorod

    Pogledajte što je "molekularna biologija" u drugim rječnicima: MOLEKULARNA BIOLOGIJA - izučava osnovne svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Najvažniji pravci u M. b. su proučavanja strukturne i funkcionalne organizacije genetskog aparata stanica i mehanizama za implementaciju nasljednih informacija... ...

    Pogledajte što je "molekularna biologija" u drugim rječnicima:- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Doznaje kako i u kojoj mjeri rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, pretvorbu energije u živim stanicama i druge pojave uvjetuju... Veliki enciklopedijski rječnik

    Pogledajte što je "molekularna biologija" u drugim rječnicima: Moderna enciklopedija

    Pogledajte što je "molekularna biologija" u drugim rječnicima:- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, biološko proučavanje strukture i funkcioniranja MOLEKULA koje čine žive organizme. Glavna područja studija uključuju fizičku i kemijska svojstva proteini i NUKLEINSKE KISELINE kao što su DNK. vidi također...... Znanstveni i tehnički enciklopedijski rječnik

    molekularna biologija- dio biologije koji istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri se odvija rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, transformacija energije u živim stanicama i... ... Mikrobiološki rječnik

    molekularna biologija- - Teme biotehnologije EN molekularne biologije ... Vodič za tehničke prevoditelje

    U kampu Elephant and Giraffe postoje pomaci u biokemiji i molekularnoj biologiji, gdje školarci, zajedno s iskusnim učiteljima s Moskovskog državnog sveučilišta, provode eksperimente i pripremaju se za olimpijade.- MOLEKULARNA BIOLOGIJA, istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri se odvija rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, transformacija energije u živim stanicama i... ... Ilustrirani enciklopedijski rječnik

    U kampu Elephant and Giraffe postoje pomaci u biokemiji i molekularnoj biologiji, gdje školarci, zajedno s iskusnim učiteljima s Moskovskog državnog sveučilišta, provode eksperimente i pripremaju se za olimpijade.- znanost koja ima za cilj razumjeti prirodu životnih pojava proučavanjem bioloških objekata i sustava na razini koja se približava molekularnoj razini, au nekim slučajevima i dostiže ovu granicu. Krajnji cilj je... Velika sovjetska enciklopedija

    Pogledajte što je "molekularna biologija" u drugim rječnicima:- proučava fenomene života na razini makromolekula (uglavnom proteina i nukleinskih kiselina) u bezstaničnim strukturama (ribosomi i dr.), u virusima, kao iu stanicama. Namjena M. b. utvrđivanje uloge i mehanizma funkcioniranja ovih makromolekula na temelju... ... Kemijska enciklopedija

    molekularna biologija- istražuje osnovna svojstva i manifestacije života na molekularnoj razini. Saznaje kako i u kojoj mjeri teče rast i razvoj organizama, pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, transformacija energije u živim stanicama i druge pojave... ... Enciklopedijski rječnik

knjige

  • Molekularna biologija stanica. Zbirka zadataka, J. Wilson, T. Hunt. Knjiga američkih autora prilog je 2. izdanju udžbenika “Molekularna biologija stanice” B. Albertsa, D. Braya, J. Lewisa i dr. Sadrži pitanja i zadatke čija je svrha produbiti…
Povezane publikacije