Прикладное значение молекулярной биологии. Прикладная молекулярная биология. Исторический экскурс по этапам развития молекулярной биологии

Молекулярный биолог – это исследователь в области медицины, миссия которого состоит, ни много ни мало, в спасении человечества от опасных болезней. Среди таких заболеваний, например, онкология, на сегодняшний день ставшая одной из главных причин смертности в мире, лишь немного уступая лидеру – сердечно-сосудистым заболеваниям. Новые методы ранней диагностики онкологии, предотвращения и лечения рака – приоритетная задача современной медицины. Молекулярные биологи в области онкологии разрабатывают антитела и рекомбинантные (генетически спроектированные) белки для ранней диагностики или целевой доставки лекарств в организме. Специалисты этой сферы используют самые современные достижения науки и техники для создания новых организмов и органических веществ с целью их дальнейшего использования в исследовательской и клинической деятельности. Среди методов, которые используют молекулярные биологи, – клонирование, трансфекция, инфекция, полимеразная цепная реакция, секвенирование генов и другие. Одна из компаний, заинтересованных в молекулярных биологах в России, – ООО «ПраймБиоМед». Организация занимается производством антител-реагентов для диагностики онкологических заболеваний. Такие антитела в основном используются для определения типа опухоли, ее происхождения и злокачественности, то есть способности к метастазированию (распространению в другие части организма). Антитела наносятся на тонкие срезы исследуемой ткани, после чего связываются в клетках с определенными белками – маркёрами, которые присутствуют в опухолевых клетках, но отсутствуют в здоровых и наоборот. В зависимости от результатов исследования назначается дальнейшее лечение. Среди клиентов «ПраймБиоМед» – не только медицинские, но и научные учреждения, так как антитела могут использоваться и для решения исследовательских задач. В таких случаях могут быть произведены уникальные антитела, способные связываться с исследуемым белком, под конкретную задачу по специальному заказу. Еще одно перспективное направление исследований компании – таргетная (целевая) доставка лекарств в организме. В данном случае антитела используются как транспорт: с их помощью лекарства доставляются непосредственно к пораженным органам. Таким образом, лечение становится более эффективным и имеет меньше негативных последствий для организма, чем, например, химиотерапия, которая поражает не только раковые, но и другие клетки. Профессия молекулярного биолога в ближайшие десятилетия, как ожидается, будет все более востребованной: с увеличением средней продолжительности жизни человека количество онкологических заболеваний будет увеличиваться. Ранняя диагностика опухолей и инновационные способы лечения с помощью полученных молекулярными биологами веществ позволят спасти жизнь и улучшить ее качество огромному количеству людей.

Основное профессиональное образование

Проценты отражают распределение специалистов с определенным уровнем образования на рынке труда. Ключевые специализации для освоения професии отмечены зеленым цветом.

Способности и навыки

• Умение обращаться с реактивами, образцами, надо уметь работать с малыми объектами
• Навыки работы с большим объемом информации
• Умение работать руками

Интересы и предпочтения

• Стремление узнавать что-то новое
• Умение работать в режиме многозадачности (необходимо следить за ходом нескольких реакций и процессов одновременно)
• Аккуратность
• Ответственность (нельзя оставить работу «на завтра», так как образцы могут быть испорчены)
• Скрупулёзность
• Трудолюбие
• Внимательность (необходимо следить за микропроцессами)

Профессия в лицах

Мария Шитова

Дарья Самойлова

Алексей Грачев

Молекулярная биология в области онкологии - перспективное профессиональное направление, так как борьба с раком - одна из приоритетных задач мировой медицины.

Специалисты-молекулярные биологи востребованы во многих областях в связи с активным развитием науки, биотехнологических и инновационных предприятий. На сегодняшний день наблюдается небольшой дефицит специалистов, особенно имеющих определенный опыт работы по специальности. До сих пор достаточно большое количество выпускников продолжает уезжать работать за границу. Сейчас начинают появляться возможности эффективной работы в области биотехнологии в России, но о массовости говорить пока рано.

Работа молекулярного биолога предполает активное участие специалиста в научной деятельности, которая становится механизмом карьерного продвижения. Развитие в профессии возможно через участие в научных проектах и конференциях, возможно через освоение смежных областей знания. Также в дальнейшем возможно академическое развитие от младшего научного сотрудника через старшего научного сотрудника к ведущему научному сотруднику, профессору и/или заведующему отделом/лабораторией.

интервью

Пирогов Сергей - участник подготовки к олимпиаде по биологии, организованной "Слон и Жираф" в 2012 г.
Победитель международной универсиады по биологии
Победитель олимпиады «Ломоносов»
Призёр регионального этапа Всероссийской олимпиады по биологии в 2012 г.
Учится в МГУ им. М.В. Ломоносова на биологическом факультете: кафедре молекулярной биологии, на 6 курсе. Работает в лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики.

- Серёжа, если у читателей появятся вопросы, они смогут их тебе задать?

Да, конечно, задать вопросы можно хоть сразу. В этом поле:

Нажмите, чтобы задать вопрос.

- Давай начнем со школы, у тебя вроде была не суперкрутая школа?

Я учился в весьма слабой московской школе школе, такой среднестатистической СОШ. Правда у нас была замечательная учительница по МХК, благодаря которой у нас появилась во многом номинальная "искусствоведческая" направленность школы.

- А что с биологией?

Биологию у нас вела очень пожилая, глуховатая и резкая женщина, которую все побаивались. Но любви к её предмету не прибавляло. Я же с детства был увлечён биологией, лет с пяти. Читал всё сам, в основном увлекаясь анатомией и зоологией. Так что школьные предметы существовали параллельно моим собственным интересам. Всё поменяли олимпиады.

- Расскажи об этом подробнее.

В 7 классе я впервые поучаствовал в муниципальном этапе (конечно, сразу почти по всем предметам, так как был единственным учеником, которого учителя имели основания отправить). И стал победителем по биологии. Тогда школа отнеслась к этому как к забавному, но не слишком интересному факту.

- Помогло ли это тебе в школе?

Помню, что несмотря на блестящую учёбу, нередко получал от преподавателя по биологии четвёрки с придирками вроде "на рисунке разреза луковицы корешки должны быть раскрашены коричневым, а не серым". Всё это было довольно удручающим. В 8 классе я снова пошёл на олимпиады, но по биологии меня почему-то не отправили. Зато стал победителем и призёром по другим предметам.

- А что было в 9 классе?

В 9 классе не пошёл на окружной этап. Там-то я неожиданно набрал слабенький, пограничный балл, который оказался всё же проходным на региональный этап. Это имело мощную мотивирующую силу - осознание того, как многого оказывается я не знаю и как много людей, всё это знающих (сколько таких людей в масштабе страны я даже боялся представить).

- Расскажи, как ты готовился.

Интенсивные самостоятельные занятие, набеги на книжные магазины и тысячи прошлогодних заданий возымели целительный эффект. Я набрал один из наибольших баллов за теорию (что тоже было для меня совершенно внезапным), прошёл на практический этап... и провалил его. В то время я ещё вообще не знал про существование практического этапа.

- Повлияла ли на тебя олимпиада?

Моя жизнь радикально изменилась. Я узнал про многие другие олимпиады, в особенности полюбил ШБО. Впоследствии на многих показывал хорошие результаты, некоторые выигрывал, благодаря "Ломоносовской" получил право на поступление без экзаменов. Параллельно я выигрывал олимпиады по истории искусства, к которому неровно дышу и поныне. Правда с практическими турами так и не дружил. В 11 классе я всё-таки дошёл до заключительного этапа, но Фортуна не была благосклонна и в этот раз я не успел заполнить матрицу ответов теоретического этапа. Зато это позволило уже не сильно беспокоиться за практический.

- Ты со многими олимпиадниками познакомился?

Да, до сих пор считаю, что мне очень повезло с кругом моих сверстников, изрядно расширивших мой кругозор. Другой стороной олимпиад, помимо мотивации более гармонично изучать предмет, было знакомство с олимпиадниками. Уже в то время я заметил, что горизонтальное общение подчас полезнее вертикального - с преподавателями на сборах.

- Как ты поступал в ВУЗ? Выбирал факультет?

После 11 класса я поступил на биофак МГУ. Как раз большинство моих тогдашних товарищей сделали выбор в пользу ФББ, но тут первоочередную роль сыграло то, что я не стал призёром всеросса. Значит мне надо было бы сдавать внутренний экзамен по математике, а в ней, особенно школьной - высшую я полюбил значительно больше - я был не силен. И в школе была очень слабая подготовка (нас даже не готовили к почти всей С части). В плане интересов уже тогда я догадывался, что, в конечном счёте, можно прийти к любому результату, вне зависимости от места поступления. Впоследствии выяснилось, что много есть и выпускников ФББ, переходивших в преимущественно мокрую биологию, и наоборот - многие хорошие биоинформатики начинали любителями. Хотя в тот момент мне и казалось, что на биофаке контингент будет не в пример слабее ФББшному. В этом я, безусловно, ошибался.

А Вы знали?

интересно

А Вы знали?

интересно

В лагере Слон и Жираф есть смены по биохимии и молекулярной биологии, где школьники вместе с опытными преподаватели из МГУ ставят эксперименты, а также готовятся к олимпиадам.

© Интервью брал Решетов Денис. Фотографии любезно предоставил Пирогов Сергей.

Молекулярная биология / м ə л ɛ к J ʊ л ər / является ветвью биологии , что касается молекулярной основы биологической активности между биомолекул в различных системах клетки , в том числе взаимодействий между ДНК , РНК , белков и их биосинтеза , а также регулирование этих взаимодействий. Запись в природе в 1961 году, Астбери описал молекулярную биологию:

Не столько техника, как подход, подход с точки зрения так называемых фундаментальных наук с ведущей идеей поиска ниже крупномасштабных проявлений классической биологии для соответствующего молекулярного плана. Он обеспокоен тем, в частности, с формами биологических молекул и [...] преимущественно трехмерным и структурно - что не означает, однако, что это всего лишь уточнение морфологии. Он должен в то же время исследовать генезис и функции.

Отношение к другим биологическим наукам

Исследователи в области молекулярной биологии используют специфические методы произрастающих молекулярной биологии, но все больше и больше комбинировать их с методами и идеями от генетики и биохимии . Существует не определенная грань между этими дисциплинами. Это показано на следующей схеме, которая изображает один возможный вид отношений между полями:

• Биохимия является изучение химических веществ и жизненно важных процессовпроисходящих в живых организмах . Биохимики тяжело сосредоточиться на роли, функции и структуры биомолекул . Изучение химии за биологических процессов и синтеза биологически активных молекулявляются примерами биохимии .
• Генетика является изучение влияния генетических различий в организмах. Это часто может быть выведенотсутствии нормальной компоненты (напримеродин ген). Изучение « мутанты » - организмыкоторыеимеют один или более функциональные компоненты по отношению к так называемому « дикому типу » или нормальному фенотипу . Генетические взаимодействия ( эпистаз) часто путают простые интерпретации таких « нокаут » исследования.
• Молекулярная биология является изучение молекулярных основ процессов репликации , транскрипции , трансляции и функции клеток. Центральная догма молекулярной биологии , где генетический материал транскрибируется в РНК и затем транслируется в белок , несмотрятоупрощенно,прежнему обеспечивает хорошую начальную точку для понимания поля. Картина была пересмотрена в свете возникающих новых ролей для РНК .

Методы молекулярной биологии

Молекулярное клонирование

Одним из самых основных методов молекулярной биологии для изучения функции белка является молекулярным клонированием . В этой технике, ДНК, кодирующий белок, представляющего интерес, клонированной с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и / или ферменты рестрикции в плазмиде (вектора экспрессии ,). Вектор имеет 3 отличительные особенности: начало репликации, а сайт множественного клонирования (MCS), и селективный маркер, как правило, с устойчивостью к антибиотикам . Расположенные выше сайт множественного клонирования являются промоторными областями и транскрипции сайта инициации, которые регулируют экспрессию клонированного гена. Эта плазмида может быть вставлена в либо бактериальные или животных клеток. Введение ДНК в бактериальные клетки может быть сделано путем трансформации с помощью поглощения голой ДНК, конъюгаций с помощью межклеточных контактов или путем трансдукции с помощью вирусного вектора. Введение ДНК в эукариотические клетки, такие как клетки животных, с помощью физических или химических средств, называется трансфекцией . Несколько различных методов трансфекции доступны, такие как фосфат кальция трансфекции, электропорации , микроинъекции и липосомальной трансфекции . Плазмида может быть интегрирована в геном , что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимыми от генома, называемого переходными процессы трансфекции.

ДНК, кодирующие белки, представляющего интереса, в настоящее время внутри клетки, и белки , теперь могут быть выражены. Разнообразные системы, такие как индуцибельные промоторы и специфических клеточных сигнальных факторов, которые помогут выразить интерес белок на высоких уровнях. Большие количества белка могут быть затем извлечены из бактериальной или эукариотической клетки. Белок может быть проверен на ферментативную активность при различных ситуациях, белка можно кристаллизовать поэтому его третичная структура может быть изучена, или, в фармацевтической промышленности, активность новых препаратов против белка может быть изучена.

Полимеразной цепной реакции

Макромолекулы-блоттинга и исследование

Термины северный , западный и восточный блоттинг получает из, что первоначально была молекулярная биология шутка, которая играла на термине Саузернет , после методики, описанной Edwin Southern для гибридизации BLOTTED ДНК. Патриция Томас, разработчик РНК - блоттинга, который затем стал известен как северному - блоттинга , на самом деле не использовать этот термин.

Саузернблоттинг

Названный в честь его изобретателя, биолог Эдвин Южный , то Саузерн - блот представляет собой метод для исследования на наличие специфической последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после фермента рестрикции (рестриктаз) перевариваний разделены с помощью электрофореза в геле, а затем переносили на мембрану с помощью блоттинга с помощью капиллярного действия . Мембрану затем подвергают воздействию меченого ДНК - зонда, который имеет последовательность оснований дополнением к последовательности на ДНК, представляющей интерес. Саузерн - блоттинг менее широко используется в научной лаборатории из - за способности других методов, таких как ПЦР , для обнаружения специфических последовательностей ДНК из образцов ДНК. Эти блоты все еще используются для некоторых применений, однако, таких как измерение трансгена числа копий в трансгенных мышах или в инженерии гена нокаутных линий эмбриональных стволовых клеток .

Северный блоттинга

Northern блот диаграмма

Восточно-блоттинга

Клинические исследования и медицинские методы лечения, вытекающие из молекулярной биологии, частично охвачены генной терапии . Применение молекулярной биологии или молекулярных клеточная биология подходов в медицине теперь называется молекулярной медициной . Молекулярная биология также играет важную роль в понимании образования, действий и нормативных актов различных частей клеток , которые могут быть использованы для эффективных предназначаться новые лекарства , болезнь диагноза и понять физиологию клетки.

дальнейшее чтение

• Cohen, SN, Чанг, НКД, Бойер, H. & Heling, RB Конструирование биологически функциональных бактериальных плазмид в пробирке .

Успехи в изучении нуклеиновых кислот и биосинтеза белка привели к созданию ряда методов, имеющих большое прикладное значение в медицине, сельском хозяйстве и ряде других отраслей.

После того, как был изучен генетический код и основные принципы хранения и реализации наследственной информации, развитие молекулярной биологии зашло в тупик, так как не было методов, которые позволяли манипулировать генами, выделять и изменять их. Появление этих методов произошло в 1970-1980х годах. Это дало мощный толчок развитию этой области науки, которая и сегодня переживает период расцвета. Прежде всего, эти методы касаются получения индивидуальных генов и их введения в клетки других организмов (молекулярное клонирование и трансгенез, ПЦР), а также методов определения последовательности нуклеотидов в генах (секвенирования ДНК и РНК). Ниже эти методы будут рассмотрены более подробно. Мы начнем с простейшего базового метода - электрофореза и затем перейдем к более сложным методам.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК

Это базовый метод работы с ДНК, применяющийся вместе с практическими всеми другими методами для выделения нужных молекул и анализа результатов. Для разделения фрагментов ДНК по длине применяется метод электрофореза в геле. ДНК - кислота, ее молекулы содержат остатки фосфорной кислоты, которые отщепляют протон и приобретают отрицательный заряд (рис. 1).

Поэтому в электрическом поле молекулы ДНК движутся к аноду - положительно заряженному электроду. Это происходит в растворе электролитов, содержащем ионы-носители заряда, благодаря чему этот раствор проводит ток. Чтобы разделить фрагменты, применяется плотный гель из полимеров (агарозы либо полиакриламида). Молекулы ДНК "запутываются" в нем тем больше, чем они длиннее, и поэтому наиболее длинные молекулы движутся медленнее всего, а наиболее короткие - быстрее всего (рис. 2). Заблаговременно или после электрофореза гель обрабатывают красителями, связывающимися с ДНК и флуоресцирующими в ультрафиолетовом свете, и получают картину полос в геле (см. рис. 3). Для определения длин фрагментов ДНК образца их сравнивают с маркером - набором фрагментов стандартных длин, нанесенных параллельно на тот же гель (рис. 4).

Важнейшими инструментами для работы с ДНК являются ферменты, осуществляющие превращения ДНК в живых клетках: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. ДНК-полимеразы осуществляют матричный синтез ДНК, что позволяет размножать ДНК в пробирке. ДНК-лигазы сшивают между собой молекулы ДНК или залечивают бреши них. Рестрикционные эндонуклеазы , или рестриктазы , разрезают молекулы ДНК по строго определённым последовательностям, что позволяет вырезать отдельные фрагменты из общей массы ДНК. Эти фрагменты могут в каких-то случаях содержать отдельные гены.

рестриктазы

Последовательности, узнаваемые рестриктазами, симметричны, и разрывы могут происходить в середине такой последовательности или со сдвигом (в одном и том же месте в обеих нитях ДНК). Схема действия разных типов рестриктаз показана на рис. 1. В первом случае получаются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие» концы. В случае «липких» концов дна цепь оказывается короче другой, образуется однонитевой участок с симметричной последовательностью, одинаковой на обоих образующихся концах.

Концевые последовательности будут одинаковыми при расщеплении любой ДНК данной рестриктазой и могут снова соединяться, так как имеют комплементарные последовательности. Их можно сшить с помощью ДНК-лигазы и получить единую молекулу. Таким образом удаётся объединить фрагменты двух разных ДНК и получить так называемые рекомбинантные ДНК . Этот подход используется в методе молекулярного клонирования, позволяющего получить индивидуальные гены и ввести их в клетки, которые могут образовывать закодированный в гене белок.

молекулярное клонирование

В молекулярном клонировании используется две молекулы ДНК - вставка, содержащая интересующий ген, и вектор - ДНК, выступающая в роли носителя. Вставку "вшивают" в вектор пр помощи ферментов, получая новую, рекомбинантную молекулу ДНК, затем эту молекулу внедряют в клетки-хозяева, и эти клетки образуют колонии на питательной среде. Колония - это потомство одной клетки, то есть клон, все клетки колонии генетически идентичны и содержат одну и ту же рекомбинантную ДНК. Отсюда термин "молекулярное клонирование", то есть получение клона клеток, содержащих интересующий нас фрагмент ДНК. После того, как колонии, содержащие интересующую нас вставку, получены, можно различными методами характеризовать эту вставку, например, определить ее точную последовательность. Также клетки могут производить кодируемый вставкой белок, если она содержит функциональный ген.

При внедрении рекомбинантной молекулы в клетки происходит генетическая трансформация этих клеток. Трансформация - процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Например, если встраиваемая молекула содержит ген устойчивости к антибиотику ампициллину, то трансформированные бактерии будут расти в его присутствии. До трансформации ампициллин вызывал их гибель, то есть у трансформированных клеток возникает новый признак.

ВЕКТОРЫ

Вектор должен обладать рядом свойств:

Во-первых, это относительно небольшая молекула ДНК, чтобы ей было легко манипулировать.

Во-вторых, для того, чтобы ДНК сохранялась и размножалась в клетке, она должна содержать определённую последовательность, обеспечивающую её репликацию (точку начала репликации, или origin of replication).

В-третьих, она должна содержать ген-маркер , который обеспечивает отбор только тех клеток, в которые попал вектор. Обычно это гены устойчивости к антибиотикам - тогда в присутствии антибиотика все не содержащие вектора клетки погибают.

Клонирование генов чаще всего проводят в клетках бактерий, так как они просты в культивировании и быстро размножаются. В клетке бактерии обычно присутствует одна большая кольцевая молекула ДНК, длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов, содержащая все необходимые бактерии гены - бактериальная хромосома. Кроме неё в некоторых бактериях существуют небольшие (несколько тысяч пар нуклеотидов) кольцевые ДНК, называемые плазмидами (рис. 2). Они, также как и основная ДНК, содержат последовательность нуклеотидов, обеспечивающую способность ДНК реплицироваться (ori). Плазмиды реплицируются независимо от основной (хромосомной) ДНК, поэтому присутствуют в клетке в большом количестве копий. Многие из таких плазмид несут гены устойчивости к антибиотикам, что позволяет отличить клетки, несущие плазмиду, от обычных клеток. Чаще используются плазмиды, несущие два гена, обеспечивающие устойчивость к двум антибиотикам, например, к тетрациклину и апмицилину. Существуют простые методы выделения таких плазмидных ДНК, свободных от ДНК основной хромосомы бактерии.

ЗНАЧЕНИЕ ТРАНСГЕНЕЗА

Перенос генов из одного организма в другой называют трансгенезом , а такие модифицированные организмы - трансгенными . Методом переноса генов в клетки микроорганизмов получают рекомбинантные белковые препараты для нужд медицины, в частности, человеческие белки, не вызывающие иммунного отторжения - интерфероны, инсулин и другие белковые гормоны, клеточные факторы роста, а также белки для производства вакцин. В более сложных случаях, когда модификация белков проходит правильно только в клетках эукариот, применяют трансгенные клеточные культуры или трансгенных животных, в частности, скот (прежде всего коз), который выделяет необходимые белки в молоко, или же белки выделяют из их крови. Так получают антитела, факторы свертывания крови и другие белки. Методом трансгенеза получают культурные растения, устойчивые к гербицидам и вредителям и обладающие другими полезными свойствами. При помощью трансгенных микроорганизмов очищают сточные воды и борются с загрязнениями, существуют даже трансгенные микробы, которые могут расщеплять нефть. Помимо этого, трансгенные технологии незаменимы в научных исследованиях - развитие биологии сегодня немыслимо без рутинного применения методов модификации и переноса генов.

технология молекулярного клонирования

вставки

Для получения индивидуального гена из какого-либо организма из него выделяют всю хромосомную ДНК и расщепляют её одной или двумя рестриктазами. Ферменты подбирают так, чтобы они не разрезали интересующий нас ген, а делали разрывы по его краям, а в плазмидной ДНК делали 1 разрыв в одном из генов устойчивости, например, к ампицилину.

Процесс молекулярного клонирования включает следующие этапы:

Разрезание и сшивание - конструирование из вставки и вектора единой рекомбинантной молекулы.

Трансформация - внедрение рекомбинантной молекулы в клетки.

Селекция - отбор клеток, получивших вектор со вставкой.

разрезание и сшивание

Плазмидную ДНК обрабатывают теми же рестриктазами, и она превращается в линейную молекулу, если подобрана такая рестриктаза, которая вносит в плазмиду 1 разрыв. В результате на концах всех образующихся фрагментов ДНК оказываются одни и те же липкие концы. При понижении температуры эти концы соединяются случайным образом, и их сшивают ДНК-лигазой (см. рис. 3).

Получают смесь кольцевых ДНК разного состава: некоторые из них будут содержать определённую последовательность ДНК хромосомной ДНК, соединённую с бактериальной ДНК, другие – соединённые вместе фрагменты хромосомной ДНК, а третьи – восстановленную кольцевую плазмиду или её димер (Рис. 4).

трансформация

Далее этой смесью проводят генетическую трансформацию бактерий, не содержащих плазмиды. Трансформация - процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. В каждую клетку может проникнуть и размножиться там только одна плазмида. Такие клетки помещают на твёрдую питательную среду, в которой содержится антибиотик тетрациклин. Клетки, в которые не попала плазмида, на этой среде расти не будут, а клетки, несущие плазмиду, образуют колонии, в каждой из которых находятся потомки только одной клетки, т.е. все клетки в колонии несут одну и ту же плазмиду (см. рис. 5).

Селекция

Далее стоит задача выделить только клетки, в которые попал вектор со вставкой, и отличить их от клеток, несущих только вектор без вставки или вовсе не несущих вектора. Этот процесс отбора нужных клеток называется селекцией . Для этого применяют селективные маркеры - обычно гены устойчивости к антибиотикам в составе вектора, и селективные среды , содержащие антибиотики или другие вещества, обеспечивающие селекцию.

В рассматриваемом нами примере клетки из колоний, выросших в присутствии ампицилина, пересевают на две среды: в первой есть ампицилин, а во второй – тетрациклин. Колонии, содержащие только плазмиду, вырастут на обеих средах, а колонии, в плазмидах которых находится встроенная хромосомная ДНК на среде с тетрациклином не вырастут (рис. 5). Среди них специальными методами отбирают те, которые содержат интересующий нас ген, выращивают в достаточных количествах и выделяют плазмидную ДНК. Из неё с помощью тех же рестриктаз, которые использовались при получении рекомбинантной ДНК, вырезают интересующий индивидуальный ген. ДНК этого гена может использоваться для определения последовательности нуклеотидов, введения в какой либо организм для получения новых свойств или синтеза нужного белка. Такой метод выделения генов называется молекулярным клонированием .

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ

В качестве генов-маркеров при исследованиях эукариотических организмов очень удобно использовать флуоресцентные белки. Ген первого флуоресцентного белка, зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein, GFP) был выделен из медузы Aqeuorea victoria и внедрен в различные модельные организмы (см. рис. 6) В 2008 году О. Симомура, М. Чалфи и Р. Тсьен получили Нобелевскую премию за открытие и применение этого белка.

Затем были выделены гены других флуоресцентных белков - красного, синего, желтого. Эти гены были модифицированы искусственно, чтобы получить белки с нужными свойствами. Разнообразие флуоресцентных белков показано на рис. 7, где изображена чашка Петри с бактериями, содержащими гены различных флуоресцентных белков.

применение флуоресцентных белков

Ген флуоресцентного белка можно сшивать с геном любого другого белка, тогда при трансляции будет образовываться единый белок - трансляционно слитый белок, или фьюжн (fusion protein), который флуоресцирует. Таким образом можно изучать, например, локализацию (расположение) любых интересующих белков в клетке, их перемещение. При помощи экспрессии флуоресцентных белков только в определенных типах клеток можно помечать клетки этих типов в многоклеточном организме (см. рис. 8 - мозг мыши, в котором отдельные нейроны имеют разные цвета за счет определенной комбинации генов флуоресцентных белков). Флуоресцентные белки - незаменимый инструмент современной молекулярной биологии.

ПЦР

Еще один метод получения генов называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) . В его основе лежит способность ДНК-полимераз достраивать вторую нить ДНК по комплементарной нити, как это происходит в клетках при репликации ДНК.

Точки начала репликации в этом методе задаются двумя небольшими фрагментами ДНК, называемыми затравками, или праймерами . Эти затравки комплементарны концам интересующего гена на двух цепях ДНК. Сначала хромосомную ДНК, из которой надо выделить ген, смешивают с затравками и нагревают до 99 о С. Это приводит к разрыву водородных связей и расхождению нитей ДНК. После этого температуру понижают до50-70 о С (в зависимости от длины и последовательности затравок). В этих условиях затравки присоединяются к комплементарным участкам хромосомной ДНК, образуя правильную двойную спираль (см. рис. 9). После этого добавляют смесь всех четырёх нуклеотидов, нужных для синтеза ДНК, и ДНК-полимеразу. Фермент удлиняет затравки, строя двуспиральную ДНК от места прикрепления затравок, т.е. от концов гена, до конца одноцепочечной хромосомной молекулы.

Если теперь снова нагреть смесь, то хромосомные и вновь синтезированные цепи разойдутся. После охлаждения к ним снова присоединятся затравки, которые берутся в большом избытке (см. рис. 10).

На вновь синтезированных цепях они присоединятся не к тому концу, с которого начинался первый синтез а к противоположному, так как цепи ДНК антипараллельны. Поэтому во втором цикле синтеза на таких цепях достроится только последовательность, соответствующая гену (см. рис. 11).

В данном методе применяется ДНК-полимераза из термофильных бактерий, способная выдерживать кипячение и работающая при температурах 70-80 о С, её не надо добавлять каждый раз, а достаточно внести в начале опыта. Повторяя процедуры нагрева и охлаждения в той же последовательности, мы можем в каждом цикле удваивать число последовательностей, ограниченных с двух концов внесёнными затравками (см. рис. 12).

После примерно 25 таких циклов число копий гена увеличится более чем в миллион раз. Такие количества легко можно отделить от внесённой в пробирку хромосомной ДНК и использовать для различных целей.

секвенирование ДНК

Ещё одним важным достижением является разработка методов определения последовательности нуклеотидов в ДНК - секвенирования ДНК (от англ. sequence - последовательность). Для этого необходимо получить чистые от других ДНК гены одним из описанных методов. Затем цепи ДНК разделяют нагреванием и прибавляют к ним затравку, меченую радиоактивным фосфором или флуоресцентной меткой. Обратите внимание, что берётся одна затравка, комплементарная одной цепи. Затем добавляется ДНК полимераза и смесь из 4-х нуклеотидов. Такая смесь делится на 4 части и к каждой добавляется один из нуклеотидов, модифицированный так, что у третьего атома дезоксирибозы он не содержит гидроксильной группы. Если такой нуклеотид включится в синтезируемую цепь ДНК, то её удлинение не сможет продолжаться, т.к. полимеразе некуда будет присоединять следующий нуклеотид. Поэтому синтез ДНК после включения такого нуклеотида обрывается. Таких нуклеотидов, называемых дидезоксинуклеотиды, добавляется значительно меньше, чем обычных, поэтому обрыв цепи происходит лишь изредка и в каждой цепи в разных местах. В результате получается смесь цепей разной длины, на конце каждой из них стоит один и тот же нуклеотид. Таким образом длина цепи соответствует номеру нуклеотида в изучаемой последовательности, например, если у нас был адениловый дидезоксинуклеотид, а полученные цепи имели длину 2, 7 и 12 нуклеотидов, значит в гене во второй, седьмой и двенадцатой позиции стоял аденин. Полученную смесь цепей легко разделить по размерам при помощи электрофореза, а синтезированные цепи выявить по радиоактивности на рентгеновской плёнке (см. рис. 10).

Получается картина, приведённая внизу рисунка, называемая радиоавтографом. Двигаясь по нему снизу вверх и читая буква над колонками каждой зоны мы получим последовательность нуклеотидов, приведённую на рисунке справа от автографа. Оказалось, что синтез останавливается не толоко дидезоксинуклеотидами, но и нуклеотидами, у которых в третьем положении сахара присоединяется какая-нибудь химическая группа, например флюоресцентный краситель. Если каждый нуклеотид пометить своим красителем, то зоны, получаемые при разделении синтезированных цепей, будут светиться разным светом. Это позволяет проводить реакцию в одной пробирке одновременно для всех нуклеотидов и разделяя полученные цепи по длине, идентифицировать нуклеотиды по цвету (см. рис. 11).

Такие методы позволили определить последовательности не только отдельных генов, но и прочитать целые геномы. В настоящее время разработаны ещё более быстрые методы определения последовательностей нуклеотидов в генах. Если парвый геном человека был расшифрован большим международным консорциумом с использованием первого приведённого метода за 12 лет, второй, с использованием второго, за три года, то сейчас это может быть сделано за месяц. Это позволяет предсказывать предрасположенность человека к многим заболеваниям и заранее принимать меры, чтобы избежать их.

Молекулярная биология пережила период бурного развития собственных методов исследования, которыми теперь отличается от биохимии. К ним, в частности, относятся методы генной инженерии , клонирования , искусственной экспрессии и нокаута генов . Поскольку ДНК является материальным носителем генетической информации, молекулярная биология значительно сблизилась с генетикой , и на стыке образовалась молекулярная генетика , являющаяся одновременно разделом генетики и молекулярной биологии. Так же, как молекулярная биология широко применяет вирусы как инструмент исследования, в вирусологии для решения своих задач используют методы молекулярной биологии. Для анализа генетической информации привлекается вычислительная техника, в связи с чем появились новые направления молекулярной генетики, которые иногда считают особыми дисциплинами: биоинформатика , геномика и протеомика .

История развития

Это основополагающее открытие было подготовлено длительным этапом исследований генетики и биохимии вирусов и бактерий .

В 1928 году Фредерик Гриффит впервые показал, что экстракт убитых нагреванием болезнетворных бактерий может передавать признак патогенности неопасным бактериям. Исследование трансформации бактерий в дальнейшем привело к очистке болезнетворного агента, которым, вопреки ожиданиям, оказался не белок , а нуклеиновая кислота . Сама по себе нуклеиновая кислота не опасна, она лишь переносит гены, определяющие патогенность и другие свойства микроорганизма.

В 50-х годах XX века было показано, что у бактерий существует примитивный половой процесс, они способны обмениваться внехромосомной ДНК, плазмидами . Открытие плазмид, как и трансформации , легло в основу распространённой в молекулярной биологии плазмидной технологии . Ещё одним важным для методологии открытием стало обнаружение в начале XX века вирусов бактерий, бактериофагов . Фаги тоже могут переносить генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Заражение бактерий фагами приводит к изменению состава бактериальной РНК . Если без фагов состав РНК сходен с составом ДНК бактерии, то после заражения РНК становится больше похожа на ДНК бактериофага. Тем самым было установлено, что структура РНК определяется структурой ДНК. В свою очередь, скорость синтеза белка в клетках зависит от количества РНК-белковых комплексов. Так была сформулирована центральная догма молекулярной биологии : ДНК ↔ РНК → белок.

Дальнейшее развитие молекулярной биологии сопровождалось как развитием её методологии, в частности, изобретением метода определения нуклеотидной последовательности ДНК (У. Гилберт и Ф. Сенгер , Нобелевская премия по химии 1980 года), так и новыми открытиями в области исследований строения и функционирования генов (см. История генетики). К началу XXI века были получены данные о первичной структуре всей ДНК человека и целого ряда других организмов, наиболее важных для медицины, сельского хозяйства и научных исследований, что привело к возникновению нескольких новых направлений в биологии: геномики, биоинформатики и др.

См. также

• Молекулярная биология (журнал)
• Транскриптомика
• Молекулярная палеонтология
• EMBO - Европейская организация молекулярных биологов

Литература

• Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.
• Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.
• Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.
• Патрушев Л. И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. - 000 с., ил. ISBN 5-02-001890-2

Ссылки

Wikimedia Foundation . 2010 .

• Ардатовский район Нижегородской области
• Арзамасский район Нижегородской области

Смотреть что такое "Молекулярная биология" в других словарях:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает осн. свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Важнейшими направлениями в М. б. являются исследования структурно функциональной организации генетического аппарата клеток и механизма реализации наследственной информации… … Биологический энциклопедический словарь

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и др. явления обусловлены … Большой Энциклопедический словарь

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Современная энциклопедия

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, биологическое изучение строения и функционирования МОЛЕКУЛ, из которых состоят живые организмы. К основным сферам изучения относятся физические и химические свойства белков и НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, таких как ДНК. см. также… … Научно-технический энциклопедический словарь

молекулярная биология - раздел биол., который исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Словарь микробиологии

молекулярная биология - — Тематики биотехнологии EN molecular biology … Справочник технического переводчика

Молекулярная биология - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Иллюстрированный энциклопедический словарь

Молекулярная биология - наука, ставящая своей задачей познание природы явлений жизнедеятельности путём изучения биологических объектов и систем на уровне, приближающемся к молекулярному, а в ряде случаев и достигающем этого предела. Конечной целью при этом… … Большая советская энциклопедия

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает явления жизни на уровне макромолекул (гл. обр. белков и нуклеиновых к т) в бесклеточных структурах (рибосомы и др.), в вирусах, а также в клетках. Цель М. б. установление роли и механизма функционирования этих макромолекул на основе… … Химическая энциклопедия

молекулярная биология - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и другие явления… … Энциклопедический словарь

Книги

• Молекулярная биология клетки. Сборник задач , Дж. Уилсон, Т. Хант. Книга американских авторов - приложение ко 2 - му изданию учебника `Молекулярная биология клетки` Б. Албертса, Д. Брея, Дж. Льюиса и др. Содержит вопросы и задачи, цель которых - углубить…